[發明專利]CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測轉基因作物NOS終止子的方法

有效

• 申請號: 202011007681.6
• 申請日: 2020-09-23
• 公開（公告）號: CN112226493B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 徐志南;黃迪;石朱偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發明提供了CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測轉基因作物NOS終止子的方法，包括如下步驟：(1)借助RPA技術對NOS終止子中的檢測片段進行擴增；(2)在crRNA的介導下，Cas12a可特異性識別擴增產物，并激活核酸酶活性，從而釋放借助ssDNA偶聯于磁珠上的產葡萄糖酶類；(3)通過磁分離，游離的產糖酶催化形成葡萄糖，并在葡萄糖氧化酶作用下生成過氧化氫。(4)借助Fenton反應，產生·OH自由基刻蝕金納米棒，呈現不同的顏色。而借助便攜式儀器可測量其吸收峰波長，實現對于NOS終止子的半定量檢測。該方法操作便攜，無需大型儀器輔助，成本低廉，且選擇性好、靈敏度高，具有一定的應用前景。

技術領域

本發明屬于可視化半定量分析方法技術領域，具體涉及CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測轉基因作物NOS終止子。

背景技術

Crispr(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，即規律成簇的間隔短回文重復序列，連同其相關Cas(Crispr Associated Protein)蛋白形成了Crispr-Cas系統，它是細菌和古菌抵抗噬菌體侵染的一種獲得性免疫機制。其中Cas12a為第2類V型Cas蛋白，它在未激活時呈自抑制狀態，當其與特定的crRNA結合后，構象將發生改變，從而形成Cas12a-crRNA二元復合物。該復合物能特異性得識別靶標DNA，并激活其核酸內切酶活性。當Cas12a依次對DNA雙鏈進行Cis切割后，該活性位點將持續暴露，因而展現出引人注目的Trans切割活性，對周圍的ssDNA進行非特異性切割。針對Cas12a的特性，科學家們設計了多種高靈敏度、高特異性的核酸檢測平臺。(1.Chen J S,Ma E,Harrington LB,et al.CRISPR-Cas12a Target Binding Unleashes Indiscriminate Single-StrandedDNase Activity.Science,2018,360(6387):436-439.2.Swarts D C,JinekM.Mechanistic Insights into the cis-and trans-Acting DNase Activities ofCas12a.Molecular Cell,2019,73(3):589-600.)

近年來，“轉基因”成了社會大眾討論的熱門話題，人們對轉基因產品作物安全性的關注程度也達到了空前的高度。為確保轉基因產品的安全，世界各國與國際組織制訂了一系列轉基因作物安全評價標準，因此不論轉基因技術的利弊，國家對轉基因作物的安全性都需要進行嚴格的把控。轉基因作物在研發、種植、生產、運輸、銷售等每個環節的所有監管過程都離不開轉基因檢測技術，這對檢測技術的成本、便攜度及時效性和靈活性都有著很高的要求。顯然，基于專業實驗室的傳統檢測方法將難以滿足所有生產環節的安全監管。因此，在生產和運輸等過程的現場，對作物是否含有外源基因進行即時檢測，從而實現對轉基因作物高效、準確且簡便、快速的監管，將成為轉基因技術在市場化過程中的重要發展方向之一，也是目前國內外分析化學的研究熱點之一。