[發(fā)明專利]CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011007681.6
• 申請(qǐng)日: 2020-09-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112226493B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐志南;黃迪;石朱偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟一：借助核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)NOS終止子中的檢測(cè)片段進(jìn)行擴(kuò)增；

步驟二：在crRNA的介導(dǎo)下，Cas12a可特異性識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物，并激活其核酸酶活性，從而釋放借助ssDNA偶聯(lián)于磁珠上的各種具有催化水解產(chǎn)生葡萄糖的產(chǎn)糖酶；

步驟三：通過(guò)磁分離，游離的產(chǎn)糖酶進(jìn)入級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)，催化底物水解產(chǎn)生葡萄糖，并在葡萄糖氧化酶的作用下生成過(guò)氧化氫；

步驟四：借助Fenton反應(yīng)，體系產(chǎn)生·OH自由基，從而刻蝕具有顏色指示作用的納米粒子，呈現(xiàn)出不同的顏色，測(cè)量其吸收峰波長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于NOS終止子的半定量檢測(cè)；

步驟一中所用的擴(kuò)增方法為RPA，擴(kuò)增所用引物序列RPA-F、RPA-D以及crRNA序列NOS-crRNA、磁珠偶聯(lián)序列MBs-Linker分別為：

RPA-F: 5’-TAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGA-3’，即序列表SEQ ID No.1序列；

RPA-D: 5’-CCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCG-3’，即序列表SEQ ID No.2序列；

NOS-crRNA:

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGUUGAAUUACGUUAAGCAU，即序列表SEQ ID No.3序列；

MBs-Linker: 5’-Biotin-N₍₁₀₀₎-Thiol-3’，即序列表SEQ ID No.4序列；

所使用的具有顏色指示作用的納米粒子為金納米棒，在檢測(cè)體系內(nèi)的濃度為0.5-1.0nM，縱向表面等離子吸收峰在810-830nm。

2.如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于：步驟二中，Cas12a濃度為50-100 nM，Cas12a與crRNA的濃度比為1:1-1:4。

3.如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于：步驟三中，反應(yīng)體系中各種底物濃度為0.02-0.95M，葡萄糖氧化酶的濃度為2-10 U/mL。

4.如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于：步驟四中，反應(yīng)體系中Fe²⁺的濃度為1-2 mM。

5.如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于：步驟二中，CRISPR/Cas12a體系的反應(yīng)溫度為25-37℃，反應(yīng)時(shí)間為15-90min；步驟三中，級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度為25-37℃，反應(yīng)時(shí)間為15-60 min；步驟四中，信號(hào)輸出體系的反應(yīng)溫度為25-37℃，反應(yīng)時(shí)間為10-60 min。

6.如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于：在功能化磁珠的制備過(guò)程中，產(chǎn)糖酶通過(guò)4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽與MBs-Linker進(jìn)行連接，MBs-Linker通過(guò)生物素基團(tuán)與鏈霉親和素修飾的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)。

7.如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物NOS終止子的方法，其特征在于：所用的產(chǎn)糖酶為轉(zhuǎn)化酶，催化底物為蔗糖。