[發明專利]一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法

在審

• 申請號: 202011003737.0
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112106635A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 蔣佳芮;李雪梅;許力;向海英;曾婉俐;高茜;米其利;楊文武;鄧樂樂;宋春滿;張建鐸
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: A01G31/00
• 分類號: A01G31/00;C05G3/00;C05G5/20
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;于洪

本發明涉及一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，屬于植物細胞工程技術領域。該方法包括篩選培養液的配制、基因編輯煙草種子消毒、種子篩選培養、是否攜帶卡那霉素抗性標簽的判定這幾大步驟。通過本發明方法可便捷有效地篩選出基因編輯素材中無轉基因標簽的素材。本發明同時利用PCR擴增載體片段的方法驗證了卡那霉素浸泡種子篩選結果的可靠性，為基因編輯煙草育種過程中繁重的篩選工作提供了經濟、便捷、可靠的篩選無標簽基因編輯煙草素材的方法，可降低篩選成本、提高生產效率。

技術領域

本發明屬于植物細胞工程技術領域，具體涉及一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法。

背景技術

基因編輯技術不僅是解析闡明基因功能的重要工具，在植物育種上更為劃時代的重大突破。CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein，串聯間隔短回文重復序列）是近幾年來新發現的一種基因定點編輯技術，CRISPR/Cas9是目前應用最多的，只需核酸酶Cas9和成熟的crRNA:tracrRNA（CRISPR-derived RNA: trans-activating RNA）復合體就可對特定外源DNA序列進行剪切，基于CRISPR/Cas系統的基因組編輯技術具有高效方便等特點。該技術已在擬南芥、煙草、水稻等多種植物中成功編輯，證明了該技術的可行性，并實現了植物抗逆境、延緩果實成熟、增加殺草劑耐受性、抗病等效果。

為了便于基因編輯材料的前期篩選，目前用于植物基因編輯載體的構建中都整合了卡那霉素抗性基因，如圖1所示。利用農桿菌轉化葉盤，通常會在培養基中加入一定濃度的卡那霉素，能有效地獲得在選擇培養基中分化的轉化苗，又可減輕后期檢測和鑒定的工作量。在煙草基因編輯育種過程中，需要在組織培養獲得的T0代分化苗中篩選出具有卡那霉素抗性的植株，以確保基因編輯載體進入到植株體內；然后經過每一代不斷的自交純合，T1代及以后需要篩選出的目的植株為基因靶點編輯成功、脫載體標簽的純合植株；自交純合后的素材篩選工作量成倍增長，分子檢測費用高昂。因此如何克服現有技術的不足，提供一種快速方便、可視化強、經濟實惠的方法來篩選基因編輯無標簽素材是目前植物細胞工程技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，包括如下步驟：

步驟（1），配制篩選培養液，所述的篩選培養液為1/2MS基本培養基+15g/L蔗糖+100~400mg/L卡那霉素；

步驟（2），對基因編輯煙草種子消毒；

步驟（3），在培養皿底部鋪無菌濾紙，將步驟（2）中消毒完成的種子轉移到濾紙上鋪開，加入步驟（1）中的篩選培養液進行培養，培養期間及時補充培養液，保持濾紙為濕潤狀態；

步驟（4），當觀察到種子萌發長出子葉時，若整棵小苗呈黃色或白色，則種子為無標簽；若呈綠色，則種子攜帶卡那霉素抗性標簽。

進一步，優選的是，步驟（1）中，所述的篩選培養液為1/2MS基本培養基+15g/L蔗糖+200mg/L卡那霉素；

進一步，優選的是，步驟（1）中，配制篩選培養液的具體步驟為：在1/2MS基本培養基中添加蔗糖至濃度為15g/L，pH值為5.5-5.9，高溫高壓滅菌，冷卻后再添加經過過濾滅菌后的卡那霉素至濃度為100~400mg/L，4℃保存備用。

進一步，優選的是，在1/2MS基本培養基中添加蔗糖至濃度為15g/L，pH值為5.7；高溫高壓滅菌的溫度為121℃，壓力為103.4kPa，時間為15-20min。