[發明專利]一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法

在審

• 申請號: 202011003737.0
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112106635A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 蔣佳芮;李雪梅;許力;向海英;曾婉俐;高茜;米其利;楊文武;鄧樂樂;宋春滿;張建鐸
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: A01G31/00
• 分類號: A01G31/00;C05G3/00;C05G5/20
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;于洪

1.一種利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），配制篩選培養液，所述的篩選培養液為1/2MS基本培養基+15g/L蔗糖+100~400mg/L卡那霉素；

步驟（2），對基因編輯煙草種子消毒；

步驟（3），在培養皿底部鋪無菌濾紙，將步驟（2）中消毒完成的種子轉移到濾紙上鋪開，加入步驟（1）中的篩選培養液進行培養，培養期間及時補充培養液，保持濾紙為濕潤狀態；

步驟（4），當觀察到種子萌發長出子葉時，若整棵小苗呈黃色或白色，則種子為無標簽；若呈綠色，則種子攜帶卡那霉素抗性標簽。

2.根據權利要求1所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的篩選培養液為1/2MS基本培養基+15g/L蔗糖+200mg/L卡那霉素。

3.根據權利要求1所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，步驟（1）中，配制篩選培養液的具體步驟為：在1/2MS基本培養基中添加蔗糖至濃度為15g/L，pH值為5.5-5.9，高溫高壓滅菌，冷卻后再添加經過過濾滅菌后的卡那霉素至濃度為100~400mg/L，4℃保存備用。

4.根據權利要求2所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，在1/2MS基本培養基中添加蔗糖至濃度為15g/L，pH值為5.7；高溫高壓滅菌的溫度為121℃，壓力為103.4kPa，時間為15-20min。

5.根據權利要求1所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，步驟（2）中，種子消毒的具體方法為：取基因編輯煙草種子于超凈工作臺上，用體積濃度為75％的酒精將種子浸泡30s，無菌水沖洗后再用質量濃度為1%的AgNO₃溶液消毒7-10min，無菌水浸泡清洗后用無菌濾紙吸干種子表面水分。

6.根據權利要求5所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，無菌水沖洗次數為至少2次；無菌水浸泡清洗次數為至少5次。

7.根據權利要求1所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，步驟（3）中，在培養皿底部鋪一張無菌濾紙，將步驟（2）中消毒完成的種子轉移到濾紙上鋪開，加入步驟（1）中的篩選培養液至將濾紙浸濕并沒過種子高度的一半。

8.根據權利要求1所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，步驟（3）中，種子篩選培養條件：溫度25±1℃，光照強度30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16h/d，培養14-21d。

9.根據權利要求1所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，收集步驟（4）種子萌發出的小苗，提取DNA，針對特異性基因序列設計引物或采用國家標準通用引物進行PCR及凝膠電泳檢測標簽條帶，以確認步驟（4）結果準確性。

10.根據權利要求9所述的利用卡那霉素快速篩選無標簽基因編輯煙草素材種子的方法，其特征在于，DNA提取使用植物基因組DNA提取試劑盒，根據說明書操作提??；PCR檢測方法使用國家標準《煙草及煙草制品轉基因檢測方法GBT 24310-2009》：35S啟動子序列擴增，擴增引物對為35S-1和35S-2，該引物對擴增片段長度205bp；nos終止子序列擴增，擴增引物對為NOS-1和NOS-2，該引物對擴增片段長度213bp；1.5%瓊脂糖凝膠電泳，145V，45min，檢測標簽條帶；

其中，35S-1：5’-ctacaaatgccatcattgcg-3’；

35S-2：5’-gggtcttgcgaaggatagtg-3’；

NOS-1：5’-gattgaatcctgyygccggt-3’；

NOS-2：5’-gtaacatagatgacaccgcg-3’。