[發明專利]粘蛋白和循環腫瘤細胞的均相可視化/熒光POCT檢測方法

有效

• 申請號: 202011002429.6
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112129736B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 陳飄飄;應斌武;謝軼;王玥;何雅秦;耿佳
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院;成都華西精準醫學產業技術研究院有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/574
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司 51202
• 代理人: 李俊

本發明提供了一種粘蛋白以及循環腫瘤細胞的均相可視化/熒光POCT檢測方法，涉及癌癥檢測技術領域，包括以下步驟：QDs選擇性識別Ag⁺和C?Ag⁺?C的現象；選擇性識別反應在mucin 1和CTCs可視化和熒光檢測中的應用；核酸序列的設計。本發明的檢測方法具有以下優點：選擇mucin 1作為CTCs新型標志物；均相策略，簡化操作步驟，易于實現；使用無酶核酸信號放大技術，可在室溫下操作和反應；采用發光納米材料作為信號分子，實現可視化快速分析；使用低成本高親和力的核酸適配體作為識別探針，無酶核酸信號放大，均相操作，發光納米材料作為信號分子，其成本可極大地降低。

技術領域

本發明涉及癌癥檢測技術領域，尤其是涉及一種粘蛋白和循環腫瘤細胞的均相可視化/熒光POCT檢測方法。

背景技術

惡性腫瘤對人類的生產生活帶來了極大地影響，其活躍生長的腫瘤通常會向外周血中釋放循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells，簡稱CTCs)。越來越多的證據支持以CTCs作為一種液態活檢標本來早期檢測癌癥復發，預后和監測治療效果。CTCs數目非常稀少，良性疾病患者體內和正常人體內沒有，早期肺癌患者體內數目稀少，但在整個癌癥發展過程中均可被檢測到，在疾病早期，CTCs可被用于預測復發風險，治療過程中，可作為標志物評估治療反應和指導治療方案。從而實現早期診斷，早期治療，復發檢測，實現真正的個體化醫療。

現有醫院CTCs檢測方法和原理為：主要由免疫磁珠富集純化、靶向探針標記和熒光定量PCR檢測三個步驟組成。

(1)免疫磁珠富集純化的作用是去除紅細胞和絕大多數的白細胞；在獲得患者血樣后，采用紅細胞裂解、離心的方法去除紅細胞，然后用免疫磁珠的方式去除絕大多數的白細胞，得到樣品中剩余的稀有細胞包括葉酸受體陽性細胞，達到對目標細胞富集的目的。

(2)靶向探針標記使用特異性小分子探針對葉酸受體陽性細胞進行標記，這種特異性小分子探針由識別葉酸受體的化學小分子與寡聚核苷酸偶聯形成。在小分子探針與葉酸受體陽性細胞充分結合后，洗滌去除未結合的探針；然后洗脫受體結合的探針，用于后續定量檢測。

(3)熒光定量PCR檢測利用針對小分子探針設計的特異性引物，結合Taqman探針，采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術，對葉酸受體結合的小分子探針中的寡聚核苷酸進行定量檢測；最終依據校準曲線定量檢測，評估樣品中葉酸受體細胞水平。

存在以下不足之處：以葉酸受體為CTCs標志物，然而部分細胞對葉酸受體的表達水平較低，即葉酸受體作為CTCs標志物，覆蓋面不全；使用葉酸和葉酸受體識別對，捕獲CTCs，使用磁珠輔助分離，檢測過程為非均相，其操作復雜，影響實驗結果準確性：使用聚合酶鏈式反應(PCR)作為信號放大技術，其需要蛋白酶參與，且反應為變溫過程，需要成熟儀器；難以實現POCT分析，以及可視化讀取：成本較高，單次收費2000-4000元，且僅僅可在大型醫院內完成，其覆蓋面較窄。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種粘蛋白均相可視化/熒光POCT檢測方法，以解決現有技術中采用葉酸受體作為循環腫瘤細胞的標志物時，由于部分細胞對葉酸受體的表達水平較低，導致覆蓋面不全；檢測過程非均相，操作復雜，影響實驗結果準確性；以及難以實現POCT分析等技術問題。

本發明的目的之二在于提供一種以粘蛋白作為標志物的循環腫瘤細胞的均相可視化/熒光POCT檢測方法。

為了實現上述目的之一，本發明一實施例提供了一種粘蛋白均相可視化/熒光POCT檢測方法，包括以下步驟：

在MOPS緩沖液中加入HP-DNA，AgNO₃或者Hg²⁺溶液，室溫下避光反應，形成具有C-Ag⁺-C結構或者T-Hg²⁺-T結構的A液；