[發明專利]花粉敗育和抗除草劑百合的培育方法

在審

• 申請號: 202011002187.0
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112210570A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 鄭思鄉;廖曉珊;榮朵艷;周俊;張翔;譚益民;湯建新;宋志偉;鄧雅文;林慶丹;吳龍云
• 申請（專利權）人: 株洲市農業科學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/56
• 代理公司: 北京智宇正信知識產權代理事務所(普通合伙) 11876
• 代理人: 于理科

本發明提供一種花粉敗育和抗除草劑百合的培育方法，步驟主要包括：S1.構建重組載體，將啟動子TA29和終止子Nos加載到Barnase上，獲得TA29?Barnase?NOs，將其插入到載體I上，擴繁后提取重組質粒；S2.步驟S1獲得的重組質粒回收目標DNA進行PCR擴增后連接到載體II上，獲得重組載體；S3.將構建好的重組載體利用農桿菌介導法轉入百合鱗片，通過除草劑篩選法獲得陽性植株，并進行農桿菌介導法體系優化，先后轉入生根和發芽誘導培養基中培養，獲得陽性轉基因百合。所獲得的百合植株被成功轉入花粉敗育基因，開花時沒有花粉生成且具備抗除草劑特性，便于種植過程使用除草劑進行高效除草，能有效地減少勞動力的使用，提高生產效益。

技術領域

本發明涉及植物培育領域，具體涉及通過基因工程將目的基因轉入百合植株并通過篩選使其獲得花粉敗育和抗除草劑特性。

背景技術

百合植株是較為常見的農業園林植物，其球莖可作為食物或是入藥，百合花則作為普遍的觀賞花卉受到人們喜愛。為滿足多樣化需求，對百合的新種質培育要求相應提高。百合種植過程中肥料、農藥的施放可以利用機械化裝置來進行，生產效率高，人工成本相對較低；相比之下，百合種植過程中的雜草清除還無法有效地利用機械化來進行，人工除草效率低下，且百合種植周期內需要進行多次除草，這就造成人工成本居高不下。此外，由于基因工程形成的轉基因植物極易通過花粉介導導致基因漂移，使得外源基因進入非轉基因植物中，造成基因污染等生物安全問題。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種百合植株的培育方法，所獲得的百合植株被成功轉入花粉敗育基因，田間鑒定為沒有花粉生成且具備抗除草劑特性，便于種植過程使用除草劑進行高效除草來代替人工除草，能有效地減少勞動力的使用，提高生產效益。

本發明的技術方案是提供一種花粉敗育和抗除草劑百合的培育方法，步驟主要包括：

S1.構建重組載體

將啟動子TA29和終止子Nos加載到Barnase上，獲得TA29-Barnase-Nos序列，將TA29-Barnase-Nos插入到載體I上，然后進行擴繁后提取重組質粒；其中TA29-Barnase-NOs序列如SEQ ID NO：1所示；

S2.步驟S1獲得的重組質粒回收目標DNA作為模板，進行PCR擴增后連接到載體II上，獲得重組載體；

S3.將構建好的重組載體利用農桿菌介導法轉入百合鱗片，通過除草劑篩選法獲得陽性植株，并進行農桿菌介導法體系優化，先后轉入生根和發芽誘導培養基中培養，獲得陽性轉基因百合。

進一步的，步驟S1中載體I為pUC57-simple載體；

進一步的，步驟S2中載體II為Pcambia3301載體；

通過載體I的初步轉化，以回收DNA作為模板構建重組載體，能夠去除對目的基因片段的連接酶活性等性質產生影響的其他基因片段，得到較純的目的基因。

進一步的，步驟S3中農桿菌介導法中采用的農桿菌濃度為OD₆₀₀值為0.4～1.0，侵染時間為5～15分鐘，共培養時間≤4天。

進一步的，步驟S3中除草劑為草甘膦，篩選濃度為1～3mg/L。

本發明的優點和有益效果：本發明通過基因工程首先將花粉敗育基因轉化至重組載體中，然后農桿菌介導法將重組載體轉入百合鱗片，通過培養獲得轉基因百合，同時通過除草劑篩選法篩選出具有抗除草劑基因的百合植株，因此所獲得植株同時具有抗除草劑特性和花粉敗育特性，而花粉敗育可以避免抗除草劑基因通過花粉為媒介的基因漂移而帶來的生物安全問題。

附圖說明

圖1為重組載體TA29-Barnase-Nos的示意圖。