[發明專利]一種高產O-乙酰-L-高絲氨酸的重組大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202011002103.3
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112063572B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 柳志強;劉鵬;張博;牛坤;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/67;C12N15/54;C12N15/53;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種高產O?乙酰?L?高絲氨酸重組大腸桿菌，及在微生物發酵制備O?乙酰?L?高絲氨酸中的應用。本發明首先通過敲除甘油代謝途徑中負責編碼阻遏蛋白的基因glpR，使得甘油激酶基因glpK和甘油3?磷酸脫氫酶基因的組成型表達，以增強菌株甘油代謝途徑的通量；其次通過過表達glpD基因發現該基因為菌株甘油代謝途徑中的關鍵基因；最后通過trc啟動子替換glpD基因的原位啟動子表明菌株發酵產O?乙酰?L高絲氨酸的水平與glpD基因的表達水平密切相關。通過以上改造策略的組合，獲得了高產O?乙酰?L?高絲氨酸的大腸桿菌菌株。

(一)技術領域

本發明屬于代謝工程領域，具體涉及一種高產O-乙酰-L-高絲氨酸重組大腸桿菌及其應用。

(二)背景技術

在微生物細胞代謝過程中，L-高絲氨酸的衍生物有O-琥珀酰-L-高絲氨酸(OSH)和O-乙酰高絲氨酸(OAH)。OSH不僅可以作為生物合成L-蛋氨酸的前體，而且是合成多種C4化合物的平臺化合物。此外，OAH也是具有潛在工業應用價值的前體化合物，可用于制備高絲氨酸與蛋氨酸等。OAH經水解可以產生高絲氨酸，而高絲氨酸可以作為L-高絲氨酸內酯、γ-丁內酯、1，4-丁二醇等平臺化合物以及農藥草銨膦合成的原料。另外，OAH能夠在乙酰高絲氨酸巰解酶的作用下直接與甲硫醇反應生成蛋氨酸和乙酸，該方法是偶聯發酵-酶法合成蛋氨酸的重要工藝路線，并具有較高的產率。

目前據報道的生產菌株中，主要通過蘇氨酸生產菌株的改造，最終通過利用葡萄糖為碳源獲得產OAH的重組菌株。楊靜等以一株改造自蘇氨酸產生菌的Escherichia coliThr L為出發菌株，過表達O-乙酰-L-高絲氨酸合成途徑中的關鍵酶高絲氨酸脫氫酶基因thr A和高絲氨酸乙酰基轉移酶基因met X，搖瓶發酵50h后，其OAH產量為1.98g/L。此外，專利報道中，以蘇氨酸高產菌株為出發菌株進行改造使其具有生產O-乙酰-L-高絲氨酸的能力，然后通過質粒過表達acs和coaA(R106A)基因，在搖瓶中發酵64h，最終得到20.3g/L的O-乙酰-L-高絲氨酸。而通過改造菌株利用甘油為碳源生物合成OAH的代謝途徑改造還未見報道。甘油是生物柴油的一種副產物，在生產生物柴油的過程中粗甘油的產量約占10％。隨著生物柴油產業的發展，粗甘油的產量也越來越多，如何有效地將甘油轉化為更高附加值的產品對于產業的發展以及環境保護領域顯得十分迫切。

(三)發明內容

本發明的目的是通過代謝工程技術，通過改造大腸桿菌的甘油代謝途徑，提供一種高產O-乙酰-L-高絲氨酸重組大腸桿菌，及在微生物發酵制備O-乙酰-L-高絲氨酸中的應用。

為實現本發明的上述目的，本發明采用的技術方案：

本發明涉及一種高產O-乙酰-L-高絲氨酸的重組大腸桿菌，由如下方法構建獲得：

一種高產O-乙酰-L-高絲氨酸的重組大腸桿菌，由如下方法構建獲得：

(1)運用CRISPR-Cas9基因編輯技術，將大腸桿菌E.coli W3110中的metJ、metI、metB、thrB、metA、lysA和iclR基因敲除，并將rhtA、thrA和eamA基因的原位啟動子替換為trc啟動子，得到重組菌株OAH-1；

(2)運用CRISPR-Cas9基因編輯技術，敲除菌株OAH-1中的glpR基因(阻遏蛋白基因)，和/或過表達glpF基因(甘油3-磷酸脫氫酶基因)，和/或用trc啟動子替換glpF基因或glpD基因的原位啟動子，得到重組菌株OAH-II；

(3)將來源于谷氨酸棒桿菌的高絲氨酸乙酰基轉移酶基因met X連接到質粒pTrc99A中，得到表達載體pTrc99A-metX，將pTrc99A-metX導入重組菌株OAH-II中，即得所述高產O-乙酰-L-高絲氨酸重組大腸桿菌。

優選的，所述重組大腸桿菌按如下方法構建：