[發明專利]一種分離純化人抗凝血酶Ⅲ的方法

在審

• 申請號: 202011001163.3
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN114249817A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 胡吉軍;周羽翕;陳嬌;何炫;陳翔宇;高玲;王強;蔣德席
• 申請（專利權）人: 四川遠大蜀陽藥業有限責任公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/22;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明提供一種分離純化人抗凝血酶Ⅲ的方法，屬于生物制品及血液制品技術領域。本發明方法中采用了UniGel?65 Heparin凝膠層析對ATⅢ進行分離純化。該層析填料以UniGel為基質，與肝素鈉進行偶聯得到，所述UniGel為表面親水修飾過的單分散球形多孔交聯聚丙烯酸酯“硬膠”層析介質，使用該肝素凝膠對ATⅢ進行分離純化能使其柱保留時間縮短至不超過3min，實現快速上樣、節約工藝時間；且分離后的本發明方法步驟為：1.取冰凍人血漿離心去除冷沉淀DEAE SephdexA50凝膠吸附，得到的DEAE SephdexA50吸附后血漿；2進行肝素親和層析，得到的洗脫液為一步層析分離純化后的ATⅢ產品；親和層析步驟為：平衡、上樣、沖洗、洗滌、洗脫，較傳統的層析步驟增加了一步沖洗，能提高ATⅢ的收率。

技術領域

本發明涉及生物制品及血液制品技術領域，具體涉及一種分離純化人抗凝血酶Ⅲ的方法。

背景技術

人抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ，以下簡稱“ATⅢ”)是血液抗凝血系統中的主要成份的主要成分，占人體總抗凝能力的70～80％，是血液中抗凝的關鍵物質，作為血液中活性凝血因子最重要的阻礙因子，它控制著血液的凝固和纖維蛋白的溶解，參與保持體內抗凝血功能和纖溶系統與凝血系統的動態平衡，并起著抗凝調節作用。臨床上，血液中ATⅢ的水平隨各種疾病、癥狀而變化，彌散性血管內凝血(DIC)、肝疾患、腎病綜合癥等疾病患者的ATⅢ血漿水平降低。

二十世紀60-70年代即開始有人報道純化ATⅢ的工藝，但是僅限于實驗室開發，1972年Heimburger等首次分離并鑒定ATⅢ為α2單鏈糖蛋白，但是其回收率較低，大約在2％左右，1974年Miller等使用肝素親和膠從血漿中純化ATⅢ，其活性回收率為34％，純度在90％以上，1979年，Wiker等用Cohn組分IV-1沉淀制備臨床用ATⅢ濃縮物。縱觀ATⅢ的分離純化歷史，除了最初采用氫氧化鋁、磷酸鈣吸附、離子交換層析等制備方法外，自1970年以來，ATⅢ的制備方法中都至少用了一次肝素親和層析，縮短了流程，提高了收率和純度。二十世紀90年代以后，國外血液制品企業開發了以層析技術為基礎的新的分離純化工藝，直接用去冷沉淀的血漿為原料進行親和層析制備ATⅢ的技術得到應用和推廣，如CSL公司、LFB公司等都采用此工藝進行制備ATⅢ制品。

國內最早報道制備ATⅢ濃縮物的專家為中國醫學科學院輸血所的劉文芳教授，也是采用肝素親和層系的方法，直接用血漿進行制備，采用巴氏病毒滅活法進行病毒滅活，最終收率大約在13～25％。比活可達7.5IU/mg左右。

由此可見肝素親和層析對分離純化ATⅢ至關重要，目前常見市售的肝素親和凝膠有GE公司生產的Heparin SepHarose FF和Capto Heparin；Tosoh公司生產的ToyopearlAF-Heparin和HC-650M-Heparin；Pall公司生產的Heparin HyperD等，采用的基質大多為葡聚糖、瓊脂糖、硅基等，此類基質耐壓性能差，生產中需要降低柱高、減小流速以防止壓力過高造成柱床塌陷，限制了批處理量及生產效率、傳質速度慢。因此現有市售的肝素親和凝膠需要在柱保留時間長、流速慢的條件下，吸附載量才會比較高，而在高流速下動態載量下降的非常快。

中國專利CN104672328B公布了一種人抗凝血酶Ⅲ的生產方法，步驟為：將新鮮冰凍人血漿去除冷沉淀獲得血漿上清，上清液使用DEAE Sephadex A50凝膠吸附處理，血漿上清沉淀除雜質蛋白后經深層過濾，濾液經Capto Heparin親和層析，S/D病毒滅活及Capto Q離子交換層析去除S/D試劑，納米膜過濾去除病毒、配制、凍干、干熱。其中該專利采用CaptoHeparin層析洗脫后，ATⅢ比活為8.45IU/mg，相對于上一階段的收率僅為60％，但未對其柱保留時間進行研究。山東大學張翠萍發表的碩士論文《人抗凝血酶Ⅲ分離純化工藝研究》中通過對比現有市售的幾種肝素親和凝膠后選擇Capto Heparin作為分離純化ATⅢ的的親和層析凝膠，關注點均在分離效果上而未對層析過程中的柱保留時間進行優化，所選用親和層析凝膠均為現市場上常銷售的幾種材料。