[發(fā)明專利]基于細胞代替熒光編碼微球檢測HCG的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011000579.3
• 申請日: 2020-09-22
• 公開（公告）號: CN112114157A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設計）人: 宮曉群;韓厚玉;常津;崔警予
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N33/76
• 分類號: G01N33/76;G01N33/554;G01N33/58
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 程小艷

本發(fā)明公開一種基于細胞代替熒光編碼微球檢測HCG的方法。首先，選用細胞,先將其用4％的多聚甲醛在37度下固定，然后加1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)將HCG的包被抗體在PBS中孵育連在細胞表面，然后在有HCG抗原的作用下在加入標記熒光的標記抗體可以形成三明治免疫夾心結構，在熒光通道下可見細胞膜一層熒光，實現(xiàn)了HCG的高效、快捷、靈敏度高、特異性強的檢測。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體為一種基于細胞代替熒光編碼微球檢測HCG的方法。

背景技術

人絨毛膜促性腺激素(HCG)是一類具有促性腺發(fā)育的蛋白類激素，生物活性與黃體生成素十分接近，其水平含量均在女性體內(nèi)不斷變化。而HCG的檢查不僅對女性早期妊娠診斷具有突出的臨床意義，還與妊娠相關疾病的診斷、治療及預后具有較為密切的關系。

在女性相關疾病中HCG的檢測有關于宮外孕，宮外孕中最常見的疾病類型即為輸卵管妊娠，妊娠婦女體內(nèi)的滋養(yǎng)層細胞較正常妊娠具有明顯的差異，孕期越長，HCG的分泌量越少，所以可將HCG作為診斷宮外孕的有效指標之一。部分生理性或病理性妊娠的孕婦，可表現(xiàn)出類甲亢樣的臨床表現(xiàn)或經(jīng)檢測其判斷甲亢的各項指標數(shù)值較為異常，而由于妊娠引起的甲亢主要是由于孕期HCG異常分泌引起的THS抑制所致。還有關于胎兒監(jiān)測中的HCG檢測，例如胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩以及胎兒窘迫癥。還有HCG在男性患者中的變化，有相關文獻報道在患膀胱癌的男性患者中HCG較正常人有明顯的變化；另外HCG對不孕癥精子的影響，因HCG與黃體生成素的結構及功能較為相似，所以其具有激發(fā)睪酮由間質(zhì)細胞產(chǎn)生，提高并存進生精功能的作用。所以HCG在臨床中的檢測具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的HCG檢測方法一般采用試紙條，檢測試劑應用免疫層析雙抗體夾心法原理，制成HCG檢測試紙，可在3分鐘內(nèi)測定尿液標本中的HCG。這種方法可以說是非常迅速，靈敏度和特異性好。然而我們看到HCG還和其它疾病息息相關，并不只是檢測早孕這么簡單，所以想要定量的檢測需要更靈敏的方法和環(huán)境友好的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服現(xiàn)有技術的不足和空白，提出一種基于細胞代替熒光編碼微球檢測HCG的方法。

本發(fā)明的技術方案：基于細胞代替熒光編碼微球檢測HCG的方法，包括如下步驟：

(1)細胞固定，孵育HCG包被抗體到細胞膜；

(2)加入HCG抗原及標記了FITC的標記抗體，形成三明治夾心結構，在激發(fā)光490nm，發(fā)射光525nm下用熒光倒置顯微鏡可見細胞膜有一層綠色熒光；

(3)在流式細胞儀下FITC通道收集熒光強度。

進一步，細胞選取乳腺癌細胞、K562、Hela或HEK293。

進一步，用于檢測HCG時所標記抗體的方法是用EDC活化羧基，細胞膜蛋白和抗體氨基和羧基共價連接，連接包括以下步驟：

首先，細胞培養(yǎng)，在傳代的時候鋪12孔板10⁴個，隔兩天固定，4％的多聚甲醛在37度固定30分鐘；

然后，在黑暗條件下加EDC，其終濃度0.1M以及包被抗體，其終濃度0.13mg/ml，在PBS中反應。

進一步，用于檢測檢測HCG時包被抗體和細胞孵育的最適時間是30分鐘。

進一步，檢測的方法是用熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀在FITC通道下進行定性和定量檢測。

有益效果：該方法具有良好的特異性、靈敏度以及抗干擾能力，為建立靈敏而特異的HCG檢測方法提供了新方向,并且用細胞代替熒光編碼微球?qū)崿F(xiàn)了生物安全，環(huán)境友好的一大優(yōu)勢。并且我們將細胞表達的顏色作為區(qū)分實現(xiàn)多檢。表現(xiàn)如下：