[發(fā)明專利]一種預測CHB患者中HBsAg清除的免疫學指標的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010997943.1
• 申請日: 2020-09-21
• 公開（公告）號: CN112379099A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 熊淑娥;祝丹;劉嘉;鄭昕
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/576
• 代理公司: 北京汲智翼成知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11381
• 代理人: 陳曦;陳琳

1.一種預測CHB患者中HBsAg清除的免疫學指標的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1、分子的篩選：

a、初步篩選出評估機體T細胞功能的免疫學指標；

b、收集HBsAg陽性和清除CHB患者以及健康對照的血樣；

步驟2、檢測方法：

a、收集患者的血樣，進行細胞重懸種植；

b、配置抗體；

c、進行流式細胞術的檢測，并保存數(shù)據(jù)，利用軟件Flow Jo software V10.0.7進行數(shù)據(jù)分析；

步驟3、CD4和CD8 T細胞的HLA-DR預測效能的評估：利用ROC曲線，評估CD4和CD8 T細胞上HLA-DR表達水平在54例CHB患者48周內(nèi)，進行HBsAg陰轉(zhuǎn)的預測效能；

步驟4、發(fā)現(xiàn)可預測CHB患者48周內(nèi)HBsAg陰轉(zhuǎn)的T細胞免疫學指標HLA-DR。

2.如權利要求1所述的預測CHB患者中HBsAg清除的免疫學指標的檢測方法，其特征在于：

所述步驟1的a過程中，免疫學指標包括代表細胞活化(CD69、HLA-DR、CD95、CD25、CD40L)、耗竭(PD-1、TIM-3、CTLA-4)以及效應功能(Granzyme B、CD107a)。

3.如權利要求1所述的預測CHB患者中HBsAg清除的免疫學指標的檢測方法，其特征在于：

所述步驟2的a過程中的細胞重懸種植，包括以下步驟：

I、取新鮮的抗凝血和血樣進行顛倒混懸，得到抗凝血血樣；

II、將上述步驟Ⅰ中得到的抗凝血血樣，緩慢倒入淋巴分離管中進行分離，得到乳白色單個核細胞層；

III、將上述Ⅱ步驟中得到的乳白色單個核細胞層，用吸管吸取至離心管中，并加入3～5ml的紅細胞裂解液混勻進行離心，去上清，加入適量的胎牛血清，用槍頭吹打重懸混勻，去上清，并加入3～5ml的磷酸鹽緩沖液重懸細胞備用；

IV、吸取10ul臺盼藍與10ul細胞懸液混勻顯微鏡下計數(shù)，洗滌細胞重懸后種植1*10⁵～1*10⁶個細胞于96孔U底板中。

4.如權利要求1所述的預測CHB患者中HBsAg清除的免疫學指標的檢測方法，其特征在于：

所述步驟2的b過程中配置抗體，包括以下步驟：

Ⅴ、將抗體1.5ulCD4、1.5ulCD8、1.5ulCD3、2ulHLA-DR以及0.5ulFVD抗體及43ul鞘液混勻；

Ⅵ、將上述Ⅳ步驟中種植細胞的96孔U底板離心1500rpm，5min，甩掉上清后將配置好的抗體混合液50ul加入相應的細胞中，輕微刮底重懸后置于4°冰箱孵育30分鐘；

Ⅶ、孵育30分鐘后取出96孔U底板，加入150ul的鞘液洗滌，離心1500rpm，5min后，甩掉上清，加入100ul的鞘液，重懸轉(zhuǎn)移至加有100ul鞘液的流式管中進行流式細胞術的檢測。

5.如權利要求1所述的預測CHB患者中HBsAg清除的免疫學指標的檢測方法，其特征在于：

根據(jù)上述步驟3的結果顯示CD4或者CD8 T細胞上HLA-DR的表達對于HBsAg 48周內(nèi)的HBsAg陰轉(zhuǎn)具有預測效能。