[發明專利]牛結節性皮膚病的競爭ELISA抗體檢測試劑盒及制備方法

在審

• 申請號: 202010988707.3
• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN112198311A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 景志忠;陳國華;賈懷杰;何小兵;房永祥;周廣青;婁忠子;李維克
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;C07K14/065;C12N15/70
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

本發明公開一種用于檢測牛結節性皮膚病的競爭ELISA抗體檢測試劑盒及制備方法。本發明的試劑盒包括：包被有GTPV?ORF117編碼的抗原蛋白的酶標板，競爭抗體，酶標二抗，樣品稀釋液，洗滌液，顯色底物，及終止液等。本發明的檢測試劑盒制備方法是：以提取的山羊痘病毒GTPV基因組DNA為模板，以SEQ ID No.1和SEQIDNo.2為引物擴增得到ORF117胞外區擴增片段，將擴增片段構建到原核表達載體pET?30a中，表達質粒轉化BL21(DE3)感受態，誘導表達獲得ORF117胞外區重組蛋白，并將其包被于酶標板上封閉；以ORF117胞外區重組蛋白免疫兔，收集抗ORF117蛋白兔血清制備競爭抗體。本發明具有制備方便，價格低廉，不影響診斷的效率，診斷制劑成本低的優點，可以滿足我國現階段LSD感染、爆發、防控的需求。

技術領域

本發明涉及一種動物傳染病檢測試劑盒及制備方法，確切講本發明涉及一 種用于檢測牛結節性皮膚病的競爭ELISA抗體檢測試劑盒及制備方法。

背景技術

牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease, LSD) 也稱為牛疙瘩皮膚病，是由痘病毒科、山羊痘病毒屬的牛結節性皮膚病病毒(Lumpy skindisease virus,LSDV) 引起的以患牛發熱，皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結節，淋巴結腫大，皮膚水腫為特征的傳染病。該病又稱結節性皮炎或塊狀皮膚病，能引起感染動物消瘦，產乳量大幅度降低，嚴重時導致死亡。臨床急需開發一種研究便捷、快速、敏感、特異的快速診斷試劑盒。

目前該病病原的檢測方法很多，包括病毒的分離及鑒定、PCR分子檢測、 病毒中和試驗、免疫熒光、電鏡分析等，這些方法具有操作復雜、費用高、需 要生物安全實驗室等，不能大范圍在基層推廣等缺點，很難在現場進行該病的 流行病學調查與監測。而血清學抗體檢測試劑盒目前國內還沒有，但我國主要 采取疫苗免疫與撲殺相結合的防控策略，血清學抗體檢測成為自然感染監測和 疫苗免疫效果評價的關鍵技術所在。

國外試劑盒(ID Screen Capripox Double Antigen Multi-species，公司ID.vet， 法國)是雙一種抗原夾心ELISA，經相關實驗表明，該試劑盒的陽性率較低， 僅為35.14％。

現階段，尋找一種簡便快捷、能大范圍推廣、對所有感染該病的牛都能進 行檢測的血清學方法顯的尤為重要。

發明內容

本發明提供一種用于檢測牛結節性皮膚病的檢測試劑盒及制備方法。

本發明的用于檢測牛結節性皮膚病的檢測試劑盒內包括：包被有 GTPV-ORF117編碼的抗原蛋白的酶標板、競爭抗體、酶標二抗、及顯色底物。

優選地，本發明的用于檢測牛結節性皮膚病的檢測試劑盒內，GTPV-ORF117 編碼的抗原蛋白為重組蛋白，所述的競爭抗體為抗GTPV-ORF117多克隆抗體； 所述的酶標二抗為以HRP標記的鼠抗兔抗體。

優選地，本發明的用于檢測牛結節性皮膚病的檢測試劑盒內，還有樣品稀 釋液、其中含有吐溫的磷酸緩沖液、酶底物TMB和終止液的2M硫酸。試劑盒 內設置這些物品可大大方便檢測作業。

本發明的牛結節性皮膚病的競爭ELISA抗體檢測試劑盒制備方法是，以提 取的山羊痘病毒GTPV基因組DNA為模板，用SEQ ID No.1和SEQIDNo.2為 引物擴增得到ORF117胞外區片段，將擴增片段酶切構建到pET-30a原核表達載 體中，轉化BL21(DE3)感受態，誘導表達制備ORF117胞外區蛋白并包被于 酶標板上，封閉；以制備的pET-30-ORF117蛋白免疫兔子，收集抗ORF117蛋 白兔血清制備競爭抗體，以鼠抗兔HRP標記的抗體為酶標二抗。