[發明專利]促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法

在審

• 申請號: 202010984944.2
• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN112094800A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 宋筱葒;鄒弼丞;鐘立武;汪敬雄;王峰
• 申請（專利權）人: 四川省恩樂生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

1.一種促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取間充質干細胞，并傳代培養；

(2)將間充質干細胞接種在培養板上，于培養基A中培養1～2天；之后于培養基B中培養，每天更換一次培養基，共培養7～8天；然后，于培養基C中培養12～15天，獲得胰島細胞；

其中，所述培養基A為含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培養基；

所述培養基B以DMEM/F12培養基為基礎培養基，并添加20～25μmol白藜蘆醇、2～3μmol全反式維甲酸、6～8μmol尼克酰胺、0.1～0.2μmol五肽胃泌素、1～10μmol L-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生長因子、1～2μmol L-谷氨酰胺成纖維細胞生長因子、0.3～0.5μmol胰高血糖素樣肽I；

所述培養基C以DMEM/F12培養基為基礎培養基，并添加20～25μmol白藜蘆醇、2～3μmol全反式維甲酸、6～8μmol尼克酰胺、1～10μmol L-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生長因子、1～2μmol L-谷氨酰胺成纖維細胞生長因子、0.05～0.1μmol胰島素樣生長因子、0.01～0.02μmol激活素A。

2.根據權利要求1所述的增殖培養方法，其特征在于，所述間充質干細胞為從臍帶分離而獲得的。

3.根據權利要求2所述的增殖培養方法，其特征在于，所述的分離的方法以及傳代方法為：取健康足月產兒臍帶，長度為5～10cm，直徑為1～2cm，于高壓滅菌的PBS溶液內放置，4℃保存，4h內使用；之后分離華通氏膠，剪成組織塊，利用10％FBS培養基培養至細胞融合度達80％以上，胰酶消化后，再用10％FBS培養基培養至細胞融合度達90％以上之后進行傳代。

4.根據權利要求1所述的增殖培養方法，其特征在于，所述培養基B以DMEM/F12培養基為基礎培養基，并添加20μmol白藜蘆醇、2.5μmol全反式維甲酸、7μmol尼克酰胺、0.18μmol五肽胃泌素、6μmol L-谷氨酰胺、0.15μmol血小板源性生長因子、1.8μmol L-谷氨酰胺成纖維細胞生長因子、0.4μmol胰高血糖素樣肽I。

5.根據權利要求1所述的增殖培養方法，其特征在于，所述培養基C以DMEM/F12培養基為基礎培養基，并添加22.5μmol白藜蘆醇、2.2μmol全反式維甲酸、7μmol尼克酰胺、6μmolL-谷氨酰胺、0.12μmol血小板源性生長因子、1.5μmol L-谷氨酰胺成纖維細胞生長因子、0.08μmol胰島素樣生長因子、0.01μmol激活素A。