[發明專利]促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法

在審

• 申請號: 202010984944.2
• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN112094800A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 宋筱葒;鄒弼丞;鐘立武;汪敬雄;王峰
• 申請（專利權）人: 四川省恩樂生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

本發明提供了一種促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法，其方法包括步驟：(1)獲取間充質干細胞，并傳代培養；(2)將間充質干細胞接種在培養板上，于培養基A中培養1～2天；之后于培養基B中培養，每天更換一次培養基，共培養7～8天；然后，于培養基C中培養12～15天，獲得胰島細胞。本發明可以獲得成熟的胰島樣細胞，并可以使得分化的細胞內外均具有含量高的胰島素和C?肽。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及細胞培養技術，具體涉及一種促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法。

背景技術

胰島移植是治療糖尿病的有效療法之一，但是胰島來源不足卻嚴重制約了該療法的臨床應用。利用干細胞強大的自我更新能力以及分化潛能，可解決胰島來源不足的問題。

現有技術通常比較關注分化細胞數目的多寡，而不重視分化細胞中的胰島素含量和C-肽含量，使得分化培養技術存在缺陷。目前，現有技術中所得的胰島β樣細胞胞外胰島素含量僅可達到200多ng/mg的水平。因此，本領域亟需一種可以提高胰島β樣細胞保內外胰島素含量的方法。

發明內容

針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法，本發明方法可以使得分化的細胞內外的胰島素和C-肽(C-peptide)的含量顯著的增加。

為了實現上述目的，本發明提供的方案如下：

一種促進間充質干細胞定向分化為胰島細胞的增殖培養方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取間充質干細胞，并傳代培養；

(2)將間充質干細胞接種在培養板上，于培養基A中培養1～2天；之后于培養基B中培養，每天更換一次培養基，共培養7～8天；然后，于培養基C中培養12～15天，獲得胰島細胞；

其中，所述培養基A為含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培養基；

所述培養基B以DMEM/F12培養基為基礎培養基，并添加20～25μmol白藜蘆醇、2～3μmol全反式維甲酸、6～8μmol尼克酰胺、0.1～0.2μmol五肽胃泌素、1～10μmolL-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生長因子、1～2μmolL-谷氨酰胺成纖維細胞生長因子、0.3～0.5μmol胰高血糖素樣肽I；

所述培養基C以DMEM/F12培養基為基礎培養基，并添加20～25μmol白藜蘆醇、2～3μmol全反式維甲酸、6～8μmol尼克酰胺、1～10μmolL-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生長因子、1～2μmolL-谷氨酰胺成纖維細胞生長因子、0.05～0.1μmol胰島素樣生長因子、0.01～0.02μmol激活素A。

在本發明的研究過程中，我們發現培養基B和培養基C的配置選擇，對于最終結果影響較大。在培養基B中，培養基中的五肽胃泌素和胰高血糖素樣肽I的添加，具有重大影響，同時，我們還發現，這兩者的添加具有一定的協同作用。值得指出的是，雖然我們發現五肽胃泌素和胰高血糖素樣肽I的添加具有重要作用，但兩者的作用是基于其它配方組分是既定的情況下的，需要配合其它組分所發揮的綜合作用。培養基C與培養基B相比，少了五肽胃泌素，多了胰島素樣生長因子和激活素A。我們發現，培養基C的優化，可以使得分化細胞的胰島素和C-肽含量更高。

在本發明中，一個可選的方案是，所述間充質干細胞為從臍帶分離而獲得的。

在本發明中，一個可選的方案是，所述的分離的方法以及傳代方法為：取健康足月產兒臍帶，長度為5～10cm，直徑為1～2cm，于高壓滅菌的PBS溶液內放置，4℃保存，4h內使用；之后分離華通氏膠，剪成組織塊，利用10％FBS培養基培養至細胞融合度達80％以上，胰酶消化后，再用10％FBS培養基培養至細胞融合度達90％以上之后進行傳代