[發(fā)明專利]一種帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系、構(gòu)建方法、鑒定方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010982121.6
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112322587A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王龍;黃進(jìn)宇;高貝貝;莫緒明;郭曉令;周亮
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州市第一人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/55;C12Q1/6881;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/573
• 代理公司: 溫州名創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

本發(fā)明屬于多能干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系、構(gòu)建方法、鑒定方法及應(yīng)用。本專利利用基因編輯方式將Cas9基因整合到人源iPS細(xì)胞基因組中，從而構(gòu)建可以進(jìn)行基因編輯的人源iPS細(xì)胞系（iPS?Cas9）。基于該iPS?Cas9細(xì)胞系，后續(xù)可以構(gòu)建任何類型的基因突變iPS細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)其分化為特定的靶細(xì)胞，建立疾病細(xì)胞模型，進(jìn)行疾病發(fā)病機(jī)理和藥物篩選研究等，具有巨大的臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于多能干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系、構(gòu)建方法、鑒定方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

2006年，Yamanaka等首次通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將四種重編程因子（Oct4, Klf4, Sox2,和c-Myc）導(dǎo)入到小鼠皮膚成纖維細(xì)胞, 進(jìn)而獲得了類似于胚胎干細(xì)胞（ES）的全能干細(xì)胞,并命名為“可誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞”（iPS）。緊接著，Takahashi等和Yu等又分別將人源成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，使得iPS細(xì)胞用于臨床的可能性又向前邁進(jìn)了一步。iPS細(xì)胞既具備了ES細(xì)胞一樣的多能性，理論上能被誘導(dǎo)分化為各種類型的細(xì)胞，同時徹底規(guī)避了ES細(xì)胞所面臨的免疫排斥和倫理學(xué)問題，具備巨大的臨床應(yīng)用價值。iPS細(xì)胞主要用于細(xì)胞分化和移植，并可提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機(jī)制、篩選新藥以及開放新的治療方法，如何使iPS細(xì)胞具有更大的應(yīng)用價值是目前需研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一方面，提供一種帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系。CRISPR/Cas9技術(shù)是目前最具價值的基因編輯技術(shù)，它可以利用特定的sgRNA引導(dǎo)Cas9酶對靶基因進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂。從而利用基因同源重組或非同源重組，在特定的靶基因序列區(qū)進(jìn)行基因編輯，引入突變，糾正突變或插入特定外源基因序列。本發(fā)明提供的iPS-Cas9細(xì)胞系，后續(xù)可以構(gòu)建任何類型的基因突變iPS細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)其分化為特定的靶細(xì)胞，建立疾病細(xì)胞模型，進(jìn)行疾病發(fā)病機(jī)理和藥物篩選研究等，具有巨大的臨床應(yīng)用價值。

本發(fā)明的第二方面，提供如上述的述的帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

（1）將能靶向人源iPS細(xì)胞AAVS1安全位點(diǎn)區(qū)的gRNA序列克隆至帶有g(shù)RNA克隆位點(diǎn)和Cas9酶基因序列的載體上，得到克隆載體；

（2）將步驟（1）得到的克隆載體和帶有藥物篩選標(biāo)記和Cas9酶的基因序列的載體共轉(zhuǎn)入人源iPS細(xì)胞中；

（3）通過外加藥物進(jìn)行篩選，獲取帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；

步驟（2）中的藥物篩選標(biāo)記與步驟（3）中外加的藥物相對應(yīng)。

優(yōu)選地，步驟（1）中，能靶向人源iPS細(xì)胞AAVS1安全位點(diǎn)區(qū)的gRNA序列為: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。

優(yōu)選地，步驟（1）中，用BbsI酶切帶有g(shù)RNA克隆位點(diǎn)和Cas9酶基因序列的載體，然后與帶BbsI酶切位點(diǎn)的且能靶向人源iPS細(xì)胞AAVS1安全位點(diǎn)區(qū)的gRNA序列行T4 DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物純化后即為克隆載體。

優(yōu)選地，步驟（2）中，通過細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀將步驟（1）得到的克隆載體和帶有藥物篩選標(biāo)記和Cas9酶的基因序列的載體共轉(zhuǎn)入人源iPS細(xì)胞中。

優(yōu)選地，所述步驟（2）中的藥物篩選標(biāo)記為嘌呤霉素藥物篩選標(biāo)記，步驟（3）中外加的藥物為嘌呤霉素。

優(yōu)選地，步驟（3）中，將步驟（2）得到的iPS細(xì)胞用帶嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選出將帶有嘌呤霉素抗藥性的iPS細(xì)胞即為帶Cas9基因的人源可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。