[發明專利]一種帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系、構建方法、鑒定方法及應用在審
| 申請號： | 202010982121.6 | 申請日： | 2020-09-17 |
| 公開（公告）號： | CN112322587A | 公開（公告）日： | 2021-02-05 |
| 發明（設計）人： | 王龍;黃進宇;高貝貝;莫緒明;郭曉令;周亮 | 申請（專利權）人： | 杭州市第一人民醫院 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/55;C12Q1/6881;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/573 |
| 代理公司： | 溫州名創知識產權代理有限公司 33258 | 代理人： | 陳加利 |
| 地址： | 310000 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 cas9 基因 人源可 誘導 多能 細胞系 構建 方法 鑒定 應用 | ||
1.一種帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系。
2.如權利要求1所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）將能靶向人源iPS細胞AAVS1安全位點區的gRNA序列克隆至帶有gRNA克隆位點和Cas9酶基因序列的載體上，得到克隆載體；
（2）將步驟（1）得到的克隆載體和帶有藥物篩選標記和Cas9酶的基因序列的載體共轉入人源iPS細胞中；
（3）通過外加藥物進行篩選，獲取帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞；
步驟（2）中的藥物篩選標記與步驟（3）中外加的藥物相對應。
3. 根據權利要求2所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的構建方法，其特征在于：步驟（1）中，能靶向人源iPS細胞AAVS1安全位點區的gRNA序列為: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。
4. 根據權利要求2所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的構建方法，其特征在于：步驟（1）中，用
5.根據權利要求2所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的構建方法，其特征在于：步驟（2）中，通過細胞電轉儀將步驟（1）得到的克隆載體和帶有藥物篩選標記和Cas9酶的基因序列的載體共轉入人源iPS細胞中。
6.根據權利要求2所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟（2）中的藥物篩選標記為嘌呤霉素藥物篩選標記，步驟（3）中外加的藥物為嘌呤霉素。
7.根據權利要求6所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的構建方法，其特征在于：步驟（3）中，將步驟（2）得到的iPS細胞用帶嘌呤霉素的培養基培養，篩選出將帶有嘌呤霉素抗藥性的iPS細胞即為帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞。
8.一種鑒定如權利要求1所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系的方法，其特征在于其包括以下步驟中的一步或多步：
（a）對細胞進行Sanger測序，檢測其中是否含有Cas9基因；
（b）對細胞進行擴增保種，然后進行mRNA提取、PCR鑒定，鑒定是否能正常表達GADPH和Cas9基因；
（c）對細胞進行擴增保種，然后進行總蛋白提取，然后進行蛋白印跡檢測，鑒定是否能正常表達GADPH和Cas9蛋白。
9.如權利要求1所述的帶Cas9基因的人源可誘導多能干細胞系用于構建建立疾病細胞模型的應用。
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