[發(fā)明專利]一種加速樹突狀細(xì)胞成熟的體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010980322.2
• 申請(qǐng)日: 2020-09-17
• 公開（公告）號(hào): CN112029724A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王剛;葉永清;鄭清富
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 和泓尚醫(yī)(成都)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0784
• 分類號(hào): C12N5/0784;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 濟(jì)南鼎信專利商標(biāo)代理事務(wù)所(普通合伙) 37245
• 代理人: 李雙

本發(fā)明涉及細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種加速樹突狀細(xì)胞成熟的體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。所述方法包括如下步驟：(1)將PBMC細(xì)胞用1640培養(yǎng)液重懸于培養(yǎng)容器中，然后將該培養(yǎng)容器至于恒溫、并提供氣體碳源的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后晃動(dòng)培養(yǎng)容器，棄去懸浮細(xì)胞，然后加入DC無血清培養(yǎng)基、GM?CSF試劑、Il?4試劑、cholesterol試劑，繼續(xù)在所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)至第三天時(shí)加入LPS，IL?1alpha，繼續(xù)培養(yǎng)至得到成熟DC細(xì)胞，即得。本發(fā)明的方法能夠顯著促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，縮短樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)，在培養(yǎng)過程中避免了血清的應(yīng)用，臨床應(yīng)用更加安全。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種加速樹突狀細(xì)胞成熟的體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)由Steinman和Cohn于1973年首先發(fā)現(xiàn)，因其表面具有星狀多形性或樹枝狀突起而得名。DC具有其他細(xì)胞所沒有得形態(tài)特點(diǎn)和運(yùn)動(dòng)能力，分布十分廣泛。DC不但具有吞噬能力，而且是迄今已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，可以有效地刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化，從而將固有免疫和獲得性免疫有機(jī)地聯(lián)系起來，在腫瘤等疾病治療中發(fā)揮重要作用。

傳統(tǒng)的DC細(xì)胞培養(yǎng)方法一般采用1640培養(yǎng)基加血清，并以GM-CSF以及Il-4做誘導(dǎo)輔以TNF-alpha作為促成熟劑，從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)歷時(shí)7-8天培養(yǎng)而成。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述這種培養(yǎng)方法具有如下不足：1.含血清培養(yǎng)，具有異源成份，臨床應(yīng)用存在安全風(fēng)險(xiǎn)。2.培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，前后長(zhǎng)達(dá)7-8天，可能對(duì)病情造成延誤。3.特異性不強(qiáng)，造成治療效果低下。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述的步子，本發(fā)明旨在提供一種加速樹突狀細(xì)胞成熟的體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，該方法能夠顯著促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，縮短樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)，在培養(yǎng)過程中避免了血清的應(yīng)用，臨床應(yīng)用更加安全。

具體地，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下所示：

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種加速樹突狀細(xì)胞成熟的體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)將PBMC細(xì)胞用1640培養(yǎng)液重懸于培養(yǎng)容器中，然后將該培養(yǎng)容器至于恒溫、并提供氣體碳源的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后晃動(dòng)培養(yǎng)容器，棄去懸浮細(xì)胞，然后加入DC無血清培養(yǎng)基、GM-CSF試劑、Il-4試劑、cholesterol試劑，繼續(xù)在所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(3)培養(yǎng)至第三天時(shí)加入LPS，IL-1alpha，繼續(xù)培養(yǎng)至得到成熟DC細(xì)胞，即得。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述培養(yǎng)箱的溫度保持37℃恒溫，并以體積濃度為5％的二氧化碳為碳源。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述預(yù)定時(shí)間為1～2h，培養(yǎng)至該時(shí)間后將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，通過搖晃培養(yǎng)容器除去培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述GM-CSF試劑在培養(yǎng)容器中的濃度為300-800U/ml，所述Il-4試劑在培養(yǎng)容器中的濃度為10-30ng/ml，所述cholesterol試劑在培養(yǎng)容器中的濃度為0.2-0.5ul/ml。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述LPS(脂多糖)在培養(yǎng)容器中的濃度為10-30ug/ml。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述IL-1alpha在培養(yǎng)容器中的濃度為20-50ng/ml。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，至少繼續(xù)培養(yǎng)至第四天時(shí)采集成熟DC細(xì)胞。