[發明專利]一種可用于指示ACE2表達量的細胞株及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010978943.7
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112143704B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 蔣明貴;方娟;劉軍鵬;劉陽;何勝;劉彩云;許澎;屈飛
• 申請（專利權）人: 湖南普拉特網絡科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;C12Q1/02;C12Q1/34;C12R1/91
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 肖云

本發明公開了一種可用于指示ACE2表達量的細胞株及其構建方法與應用，所述構建方法包括以下步驟：S1、設計并構建能切割ACE2基因組的sgRNA/Cas9蛋白共表達載體；S2、構建含ACE2基因同源序列、標記基因的donor載體；S3、將sgRNA/Cas9蛋白共表達載體和donor載體共轉染工具細胞Huh7?細胞，篩選陽性克隆，得到所述細胞株；其中，所述sgRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。本發明構建的細胞株可用于冠狀病毒等的篩選，效率高，成本低，在抗擊新冠疫情中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及基因工程和基因遺傳修飾技術領域，具體涉及一種可用于指示ACE2表達量的細胞株及其構建方法與應用。

背景技術

冠狀病毒是自然界廣泛存在的一大類病毒，主要感染脊椎類動物，如人、鼠、豬、禽類等，因其病毒形態在電鏡下觀察似王冠而得名。2019新型冠狀病毒(2019-nCov，引發新型冠狀病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引發重癥急性呼吸綜合征)和MERS-CoV(引發中東呼吸綜合征)。截止到2020年8月中旬，因新型冠狀病毒感染的肺炎(Novelcoronavirus pneumonia，NCP)在世界范圍內已造成接近2000萬例感染，并造成接近80萬例死亡，給全世界社會、經濟、政治、生活都造成了嚴重影響。相關研究表明，冠狀病毒是通過S蛋白與宿主的受體結合，從而感染宿主細胞。冠狀病毒S蛋白的多樣性高、機制復雜，β屬冠狀病毒的S蛋白大小以及在細胞表面與其結合的受體都各不相同。前期研究證實，SARS-Cov是通過細胞膜表面ACE2受體進入細胞。而我國病毒所石正麗研究團隊通過實驗證明2019-nCoV可以通過細胞膜表面ACE2受體進入細胞，這與SARS-CoV進入細胞的途徑是一樣的。這些都提示ACE2可能是新型冠狀病毒的潛在治療靶點。

自國家病原微生物資源庫于2020年1月24日發布由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所成功分離的我國第一株病毒毒種信息及其電鏡照片(如圖1所示)以來，醫藥領域的各研發人員正在奮力研究其相關檢測及防治藥物。目前，準確檢測技術研究已取得較一定的進展，而防治藥物還尚未面世。因此，加快促進可靠藥物的研制具有重要意義。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提出一種細胞株的構建方法，該方法通過CRISPR/Cas技術構建得到的細胞株能夠用于指示冠狀病毒受體ACE2表達量。

本發明還提出上述方法構建得到的細胞株。

本發明還提出上述細胞株的應用。

根據本發明的第一方面實施方式的構建方法，包括以下步驟：

S1、設計并構建能切割ACE2基因組的sgRNA/Cas9蛋白共表達載體；

S2、構建含ACE2基因同源序列、標記基因的donor載體；

S3、將sgRNA/Cas9蛋白共表達載體和donor載體共轉染工具細胞Huh7-細胞，篩選陽性克隆，得到所述細胞株；

其中，所述sgRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

根據本發明的一些實施方式，所述ACE2基因同源序列包括同源左臂序列和同源右臂序列，所述同源左臂序列如Seq ID No.2所示，所述同源右臂序列如Seq ID No.3所示。