[發(fā)明專(zhuān)利]一種無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010976255.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112063579B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉輝;王亦平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海培暉生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/077
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/077;G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 廣州幫專(zhuān)高智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44674
• 代理人: 顏德昊

本發(fā)明提出了一種無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。該培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及加入其中的L?抗壞血酸、維生素E、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉、亞硒酸鈉、谷氨酰胺、rhIL?2、CpG寡聚核苷酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、BSA、甘油磷酸鈉、HEPES、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、rhu?EPO培養(yǎng)的人類(lèi)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清。本發(fā)明便于批次之間的質(zhì)量控制；采用rhu?EPO培養(yǎng)的人類(lèi)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清提供骨髓生長(zhǎng)需要的生長(zhǎng)因子，降低生產(chǎn)成本；采用甘油磷酸鈉等作為pH緩沖系統(tǒng)，其pH值更穩(wěn)定，保存過(guò)程中pH值穩(wěn)定。采用rhIL?2、CpG寡聚核苷酸刺激B細(xì)胞活性，用于核型分析時(shí)獲得更多的核型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

染色體畸變與血液系統(tǒng)疾病具有緊密的相關(guān)性。近年來(lái)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)和染色體顯帶等技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞遺傳學(xué)成為血液系統(tǒng)疾病分析、研究中不可缺少的重要內(nèi)容。骨髓染色體核型分析用于血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療、預(yù)后、發(fā)病機(jī)制研究具有非常重要的作用。然而，骨髓染色體核型制備過(guò)程復(fù)雜，影響因素多，成功率低且成本高，獲得的分裂相少，染色體粗短，而且分散不好。

傳統(tǒng)的骨髓培養(yǎng)基由RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素、碳酸氫鈉等組成；為了提高骨髓培養(yǎng)基的效果，近年來(lái)，已有一些骨髓培養(yǎng)基；例如程建兵、夏成青、陳紅梅等采用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胎牛血清和人類(lèi)淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物配置骨髓培養(yǎng)基；谷超采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、人類(lèi)淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物和化合物Cephaloziellin?N配置骨髓培養(yǎng)基；上述兩種骨髓培養(yǎng)基培養(yǎng)出的骨髓細(xì)胞用于染色體G制片，均取得良好的效果。但是，上述骨髓培養(yǎng)基均含有胎牛血清，成分復(fù)雜，易出現(xiàn)真菌、支原體等污染；還有就是血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不一，這對(duì)大批量生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，很容易造成培養(yǎng)基質(zhì)量不穩(wěn)定，并且價(jià)格也較高。此外，上述兩種骨髓培養(yǎng)基含有人類(lèi)淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度為60-140ul/ml，濃度較高，用于批量生產(chǎn)，難以獲得滿足生產(chǎn)所需要的人類(lèi)淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，并且成本也高。

因此，為了降低成本，便于批量生產(chǎn)，質(zhì)量穩(wěn)定，建立一種骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)良好，分裂相多且清晰，形態(tài)好而且分散度良好的無(wú)血清骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基制備和應(yīng)用尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基，使培養(yǎng)出的骨髓細(xì)胞用于G顯帶染色體核型分析時(shí)，背景清晰，染色體分裂相多，形態(tài)好且分散度好，易于觀察，而且成本低，質(zhì)量穩(wěn)定。

此外，本發(fā)明還提出了上述無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基的制備方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以及加入該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的L-抗壞血酸、維生素E、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉、亞硒酸鈉、谷氨酰胺、rhIL-2、CpG寡聚核苷酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、BSA、甘油磷酸鈉、HEPES、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、rhu-EPO培養(yǎng)的人類(lèi)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清。

作為優(yōu)選地，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選地，所述無(wú)血清骨髓培養(yǎng)基的各組分的濃度為：