[發(fā)明專利]一種無血清骨髓培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010976255.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-16
• 公開（公告）號(hào): CN112063579B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉輝;王亦平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海培暉生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077;G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 廣州幫專高智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44674
• 代理人: 顏德昊

1.一種無血清骨髓培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，

以及加入該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的L-抗壞血酸、維生素E、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉、亞硒酸鈉、谷氨酰胺、rhIL-2、CpG寡聚核苷酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、BSA、甘油磷酸鈉、HEPES、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、rhu-EPO培養(yǎng)的人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清；

所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基；

L-抗壞血酸在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5-20mg/L；

維生素E在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5-15mg/L；

青霉素在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為1×10⁵U/L；

鏈霉素在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為50mg/L；

丙酮酸鈉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為80-120mg/L；

亞硒酸鈉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10-20nM；

谷氨酰胺在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10-30mM；

rhIL-2在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0.005-0.05mg/L；

CpG寡聚核苷酸在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-5uM；

亞油酸在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0.1-0.5mg/L；

亞麻酸在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0.1-0.5mg/L；

硬脂酸在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5-15uM；

BSA在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為2g-10g/L；

甘油磷酸鈉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5-15g/L；

HEPES在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為3-6g/L；

NaH₂PO₄在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為1-5g/L；

Na₂HPO₄在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-1.5g/L；

rhu-EPO培養(yǎng)的人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-5mL/L；

rhu-EPO培養(yǎng)的人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法如下：

人類淋巴細(xì)胞1×10⁶個(gè)/mL接種于含有1~10IU/L?rhu-EPO的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，收集細(xì)胞1500rpm離心10分鐘后，收集上清，然后上清液進(jìn)行4500rpm離心20分鐘，收集上清即可；

所述的無血清骨髓培養(yǎng)基中CpG寡聚核苷酸為DSP-30，采用硫代磷酸修飾。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清骨髓培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

取上述無血清骨髓培養(yǎng)基的各組分，按照各自濃度使用量，加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中充分溶解混勻，然后0.22uM濾膜過濾除菌分裝成5ml/瓶，即得。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無血清骨髓培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，

rhu-EPO培養(yǎng)的人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法如下：

人類淋巴細(xì)胞1×10⁶個(gè)/mL接種于含有1~10IU/L?rhu-EPO的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，收集細(xì)胞1500rpm離心10分鐘后，收集上清，然后上清液進(jìn)行4500rpm離心20分鐘，收集上清即可。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清骨髓培養(yǎng)基在制備骨髓染色體核型分析試劑中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用的步驟包括：

將骨髓細(xì)胞以1.5～2×10⁷個(gè)接種到上述的無血清骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)或者48小時(shí)，終止培養(yǎng)前2小時(shí)沒加入秋水仙素；收集細(xì)胞，低滲、預(yù)固定、固定、滴片、烤片老化、胰酶消化、Giemsa染色，然后可進(jìn)行染色體核型分析。