[發(fā)明專利]一種新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010974969.4
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112226464B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓正濱;李佳琪;于浩然;汪夢蕓;何佳;吳瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，提供了一種新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明為了獲得一種可用于新冠病毒致病機理、藥物及疫苗研發(fā)的動物模型，以mT/mG小鼠作為實驗動物，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，通過將3’端帶有polyA序列的人的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶hACE2的CDS序列插入到小鼠內(nèi)源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶mACE2起始密碼子之前的方法，獲得了一種可紅?綠熒光轉(zhuǎn)換的新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型，該模型解決了hACE2隨機插入及小鼠內(nèi)源ACE2蛋白表達的問題，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒感染過程的跟蹤、定位和檢測，可極大方便后續(xù)的研究和應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

動物模型是新冠病毒藥物、疫苗研發(fā)的關(guān)鍵一環(huán)，也是深入開展病毒致病機理等研究必不可少的工具。非人靈長類動物(如猴子)雖然更接近人類，但由于價格高、周期長、操作不便等問題，不適合普遍推廣和應(yīng)用。小鼠作為最常用的實驗動物，仍然是動物模型的首選，但由于病毒受體(ACE2)結(jié)構(gòu)與人的存在較大差異，導(dǎo)致小鼠對于新冠病毒不易感，不能直接應(yīng)用于實驗。

與SARS病毒類似，新冠病毒(COVID-19)也是通過人類細胞表面受體蛋白ACE2介導(dǎo)入侵細胞。之前在研究SARS的過程中，國內(nèi)外已建立了幾個表達人源ACE2的小鼠模型，如McCray等(2007)、Tseng等(2007)以及我國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)(2007)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(2008)等單位均建立了hACE2小鼠。這些小鼠模型的共同缺陷就是hACE2的隨機插入導(dǎo)致整合位點和拷貝數(shù)都無法控制，一方面，隨機插入可能對小鼠造成潛在的負面影響；另一方面，人源ACE2表達的同時小鼠內(nèi)源ACE2也同樣表達，很可能造成小鼠模型不能很好地再現(xiàn)人類的疾病特征。更為重要的是，這些傳統(tǒng)的小鼠模型無法快速、直觀反映病毒感染情況，也無法實時研究病毒感染過程。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有的新冠病毒人源化受體小鼠模型hACE2隨機插入及小鼠內(nèi)源ACE2蛋白表達的問題，本發(fā)明提供了一種新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型的構(gòu)建方法，構(gòu)建策略如圖1所示，具體方法如下：

1)gRNA的設(shè)計：在小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶mACE2基因第二外顯子起始密碼子ATG附近設(shè)計2個gRNA位點；

2)Donor DNA的設(shè)計：將人源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶hACE2的上游同源臂、人源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶hACE2的CDS序列、polyA序列和人源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶hACE2的下游同源臂連接作為Donor DNA片段；

3)顯微注射：將步驟1)獲得的2個gRNA、步驟2)獲得的Donor DNA、Cas9蛋白及Microinjection buffer混合，注射到mT/mG小鼠受精卵的原核中，得到胚胎；

4)胚胎移植：將步驟3)獲得的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至2-細胞后，進行輸卵管移植，再將2-細胞胚胎移植到假孕母鼠的輸卵管中，由母鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，直至仔鼠出生；

5)基因型鑒定：對步驟4獲得仔鼠的基因型進行鑒定，帶有人源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶hACE2基因序列的仔鼠即為新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶mACE2基因第二外顯子的序列如SEQ ID No.4所示。

進一步地限定，步驟1)中的兩個gRNA分別為gRNA-1和gRNA-2，所述gRNA-1序列如SEQ ID No.1所示，所述gRNA-2序列如SEQ ID No.2所示。

進一步地限定，步驟2)中人源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶hACE2的CDS序列如SEQ ID No.5所示。

進一步地限定，步驟2)中所述上游同源臂序列如SEQ ID No.11所示，下游同源臂序列如SEQ ID No.12所示。