[發明專利]一種新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 202010974969.4
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112226464B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 韓正濱;李佳琪;于浩然;汪夢蕓;何佳;吳瓊
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型的構建方法，其特征在于，方法如下:

1)gRNA的設計：在小鼠血管緊張素轉換酶mACE2基因第二外顯子起始密碼子ATG附近設計2個gRNA位點，分別gRNA-1和gRNA-2，所述gRNA-1序列如SEQ ID No.1所示，所述gRNA-2序列如SEQ ID No.2所示；

2)Donor DNA的設計：將人源血管緊張素轉換酶hACE2的上游同源臂、人源血管緊張素轉換酶hACE2的CDS序列、polyA序列和人源血管緊張素轉換酶hACE2的下游同源臂連接作為Donor DNA片段；

3)顯微注射：將步驟1)獲得的2個gRNA、步驟2)獲得的Donor DNA、Cas9蛋白及Microinjection buffer混合，注射到mT/mG小鼠受精卵的原核中，得到胚胎；

4)胚胎移植：將步驟3)獲得的胚胎繼續培養至2-細胞后，再將2-細胞胚胎移植到假孕母鼠的輸卵管中，直至仔鼠出生；

5)基因型鑒定：對步驟4） 獲得仔鼠的基因型進行鑒定，帶有人源血管緊張素轉換酶hACE2基因序列的仔鼠即為新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述小鼠血管緊張素轉換酶mACE2基因第二外顯子的序列如SEQ ID No.4所示。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中所述人源血管緊張素轉換酶hACE2的CDS序列如SEQ ID No.5所示。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中所述上游同源臂序列如SEQID No.11所示，下游同源臂序列如SEQ ID No.12所示。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，上游同源臂引物-F如SEQ ID No.13所示，上游同源臂引物-R如SEQ ID No.14所示，下游同源臂的引物-F如SEQ ID No.15所示，下游同源臂的引物-R如SEQ ID No.16所示。

6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述Donor DNA的序列如SEQ IDNo.17所示。

7.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟3)中所述的混合方法是將gRNA-1、gRNA-2、Donor DNA和Cas蛋白按照5:5:2:25的終濃度比混合。

8.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟3)中所述的小鼠受精卵在顯微注射前經37℃孵育15分鐘。

9.權利要求1所述的構建方法獲得的新冠病毒人源化受體hACE2小鼠模型在新冠病毒致病機理研究、藥物或疫苗研發中的應用。