[發明專利]一種促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法

在審

• 申請號: 202010974672.8
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112011506A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 霍亞如;黃金剛
• 申請（專利權）人: 鄭州佐爵生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 鄭州芝麻繪智知識產權代理事務所(普通合伙) 41191
• 代理人: 李玲玲

本發明公開了一種促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法，包括在骨髓間充質干細胞原代培養的基礎培養基中添加猴菇多糖、接骨木黃酮、石榴多酚，以培養基的終體積計，所述猴菇多糖的添加濃度為20?35μg/mL，所述接骨木黃酮的添加濃度為50?70μg/mL，所述石榴多酚的添加濃度為65?80μg/mL。本發明提供一種促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法，選擇在骨髓間充質干細胞原代培養的培養基中添加植物提取物猴菇多糖、接骨木黃酮、石榴多酚，刺激原代培養的細胞，提高細胞進行有絲分裂的活性，縮短細胞增殖的緩滯期，提高對數期細胞的增殖速度，從而大大增加用于傳代培養的細胞數量，并且避免了在傳代培養過程中添加外源性成分影響干細胞臨床應用的問題，提高骨髓間充質干細胞的質量。

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法。

背景技術

干細胞的臨床治療需要合適的種子細胞。目前研究較多的胚胎干細胞是最早被分離得到的多能干細胞，體外培養可保持穩定增殖能力，具有向多個胚層方向分化的潛能。但是胚胎干細胞一般是來自于異源性組織的細胞，有免疫排斥的風險。自體組織中，骨髓中含有多中干細胞已被多次報道，且有多例臨床報道骨髓干細胞移植可幫助治療其他非造血系統疾病。

骨髓中除含造血干細胞外，還存在著一種具有向中胚層和神經外胚層組織細胞分化能力的多能干細胞即骨髓間充質干細胞。骨髓間充質干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于骨髓組織中的一類具有自我更新、增殖能力強，及多向分化能力的間充質干細胞。骨髓干細胞的可以分化成各種間充質來源的細胞，如成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肝細胞、肌細胞、神經細胞等，是未來干細胞在醫療應用上具有巨大潛力的理想種子細胞。

研究間充質干細胞體外擴增對骨組織工程的發展具有重要意義，骨組織工程的研究大多趨向于采用骨髓間充質干細胞作為種子細胞。但是和造血干細胞相比骨髓間充質干細胞的數量少，成人骨髓平均10萬個有核細胞含有一個骨髓間充質干細胞，骨髓間充質干細胞采集數量有限，一般需在體外培養擴增20余天才能達到滿足組織工程所需的細胞數量。且隨著年齡的增加細胞的數量會逐漸減少，極大的限制了骨髓間充質干細胞在臨床上應用。因此解決細胞快速擴增的問題是目前骨髓間充質干細胞臨床應用的關鍵之一。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法，通過在原代培養過程中添加猴菇多糖、接骨木黃酮、石榴多酚，提高原代培養過程中細胞的活躍度，縮短原代培養的時間，提高增殖效率。

本發明的目的采用如下技術方案實現：

一種促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法，包括在骨髓間充質干細胞原代培養的基礎培養基中添加猴菇多糖、接骨木黃酮、石榴多酚，以培養基的終體積計，所述猴菇多糖的添加濃度為20-35μg/mL，所述接骨木黃酮的添加濃度為50-70μg/mL，所述石榴多酚的添加濃度為65-80μg/mL。

上述促進骨髓間充質干細胞體外增殖的方法，包括以下步驟：

(1)提取分離人骨髓間充質干細胞，以1-2×10⁴個/mL在基礎培養基中接種后進行原代培養，所述基礎培養基中加入猴菇多糖、接骨木黃酮、石榴多酚、胎牛血清，以培養基的終體積計，所述猴菇多糖的添加濃度為20-35μg/mL，所述接骨木黃酮的添加濃度為50-70μg/mL，所述石榴多酚的添加濃度為65-80μg/mL，所述胎牛血清的用量為培養基終體積的5-10％，在37℃、5％CO₂的條件下培養，每2-3天更換培養基，至細胞融合度達到80％-85％，用胰酶消化傳代；

(2)取上述步驟(1)中胰酶消化后的細胞以1-2×10⁵個/mL接種于完全培養基中，進行傳代培養，傳代培養過程在37℃、5％CO₂的條件下進行，每隔3d全量換培養液。