[發明專利]一種蔗糖誘導細菌固態發酵生產可拉酸及純化方法

在審

• 申請號: 202010973714.6
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN111893150A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 季學猛;王碩
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C08B37/00;C12R1/01
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 王雨杰;張艷梅

本發明創造提供了一種蔗糖誘導細菌固態發酵生產可拉酸及純化方法，包括如下步驟：步驟一：將具有可拉酸合成基因的變形菌門細菌作為生產菌種放入培養基中進行固態培養，培養基中加入蔗糖，并收集菌體與分泌物；步驟二：刮取固體上培養的菌體與分泌物并溶于水；步驟三：將容有菌體和分泌物的水煮沸后離心沉淀菌體，棄去沉淀，保留上清液；步驟四：在步驟三得到的上清液中加入冰醋酸離心沉淀脂多糖，棄去沉淀，保留上清液；步驟五：將步驟四得到的上清液離心純化真空干燥后得到可拉酸固體。本發明創造所述的方法第一次通過固態培養且用蔗糖誘導可拉酸基因過表達發酵生產可拉酸，不僅產量高，發酵時間短，而且產物易于純化。

技術領域

本發明創造屬于可拉酸生產領域，尤其是涉及一種蔗糖誘導細菌固態發酵生產可拉酸及純化方法。

背景技術

微生物胞外多糖是細菌、真菌、藍藻等微生物在代謝過程中產生的對微生物有保護作用的生物高聚物。在自然條件下，多數細菌被多糖包被。包被于細菌表面的多糖對于細菌在競爭環境中的存活和生長都有重要作用。多糖的存在一方面可以提高細菌對抗菌物質的耐受能力，如表面活性劑、抗生素和吞噬細胞等，另一方面，胞外多糖可以提高細菌對不良環境的適應能力，如防止細胞失水、防止細胞凍傷等。另外，微生物胞外多糖具有獨特的物理和流變特性，在食品工業中被廣泛用作穩定劑、增稠劑、凝膠劑和乳化劑。近年來研究發現細菌多糖在抗腫瘤、抗病毒、免疫刺激、抗炎癥活性和抗氧化作用、抗微生物作用等方面表現出了顯著的生物活性，因此引起了人們的更多關注。

可拉酸(Colanic acid)是胞外多糖的一種，主要發現存在于腸桿菌中。可拉酸是一種白色纖維狀的無定型結構雜多糖，主要由D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-巖藻糖組成，還包含O-乙酰和丙酮酸等多種側鏈上的化學修飾結構，是一種高分子量的雜多糖?？衫岚诩毎砻?，能使菌株表現出黏液化現象，在干燥環境條件下，黏液化突變菌株較野生菌株有較強的存活力。2017年在雜志cell上首次報道了可拉酸使得線粒體片段化且具有延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用。目前主流觀點認為真核生物的線粒體來源于變形菌門細菌，而多數變形菌門細菌含有可拉酸合成基因，因此，可拉酸對于真核生物細胞的線粒體具有調控作用是不難理解的。變形菌門細菌在人體腸道中大量存在，因此，可拉酸也是腸道中天然存在的細菌分泌物。

衰老與長壽是人類永久的研究課題，而可拉酸對健康可能有促進作用，可拉酸的功能與作用機制或許成為未來的研究熱點。但是，目前仍然沒有商品化的可拉酸提取物，也缺少完善的可拉酸生產與純化方法，這嚴重限制了可拉酸的研究。因此亟需可拉酸發酵與純化方法的研究。目前已報道的利用大腸桿菌生產可拉酸的產量很低，在已有的文獻報道中，最高產量在1g/L。提高微生物發酵生產可拉酸的產量是很重要的科學研究。液態發酵為減少后續純化成本，往往采用基礎培養基發酵，導致細菌的生長狀態不理想，在已有的文獻報道中，可拉酸濃度最高時菌株的OD600僅為5.0左右。而采用LB等培養基發酵生產可拉酸，雖然可以獲得較高細菌密度，但是也會引入較多雜質，增加了產物純化難度。

發明內容

有鑒于此，本發明創造旨在克服現有技術中的缺陷，提出一種蔗糖誘導細菌固態發酵生產可拉酸及純化方法。

為達到上述目的，本發明創造的技術方案是這樣實現的：

一種蔗糖誘導細菌固態發酵生產可拉酸及純化方法，包括如下步驟：

步驟一：將具有可拉酸合成基因的變形菌門細菌作為生產菌種放入培養基中進行固態培養，培養基中加入蔗糖，并收集菌體與分泌物；

步驟二：刮取固體上培養的菌體與分泌物并溶于水；

步驟三：將容有菌體和分泌物的水煮沸后離心沉淀菌體，棄去沉淀，保留上清液；

步驟四：在步驟三得到的上清液中加入冰醋酸離心沉淀脂多糖，棄去沉淀，保留上清液；

步驟五：將步驟四得到的上清液離心純化真空干燥后得到可拉酸固體。