[發明專利]基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010973070.0
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112239795A
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 李富友;王瑞;徐明
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及基于RT?RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒。包括反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系在反應前物理分隔成溶液不連通的兩部分；所述檢測試劑盒使用時，RT?RPA擴增完成后，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系混勻，混勻體系中的各試劑濃度稱為工作濃度。與現有技術相比，本發明的檢測試劑盒可以將整個反應在同一管中進行，只在加樣時開蓋一次，大大簡化了操作并且避免了擴增子干擾的風險，檢測靈敏度可達單分子水平，并且只需要一個簡單的熱塊和便攜藍光燈即可實現檢測，適用于對新冠病毒的現場快速高靈敏篩查。

技術領域

本發明屬于核酸檢測領域，尤其是涉及一種基于RT-RPA和CRISPR的可視化 新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒。

背景技術

新冠病毒可以通過人傳人傳播，并且有14天左右的潛伏期，因此對新冠病毒 的快速、高靈敏篩查非常必要。

現有的新冠病毒檢測“金標準”主要是基于反轉錄PCR的檢測方法。但是該 方法儀器復雜，成本高，非便攜，不適用于對新冠病毒的現場快速檢測。新興的恒 溫擴增方法如重組聚合酶擴增(RPA)、環介導恒溫擴增(LAMP)、交叉引物恒溫 擴增(CPA)可在單一溫度下進行，大大降低了對儀器的要求，但是其檢測靈敏度 有待提高。

基于CRISPR的檢測方法通過擴增子被向導RNA識別激活Cas12a酶，利用 Cas12a酶的旁系切割活性切割探針實現對檢測信號的二次放大，檢測靈敏度可達 到單分子水平。快速PCR和CRISPR結合的核酸檢測方法被開發(Ultrafast visual nucleic acid detectionwith CRISPR/Cas12a and rapid PCR in single capillary，doi： https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128618)。但是現有的基于CRISPR的檢測方法操 作復雜，并且兩步法容易造成擴增子氣溶膠污染，并且有較高的背景信號干擾。

因此開發操作簡便、靈敏度高的核酸檢測方法對新冠病毒的核酸現場檢測有 著非常重要的作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型的基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒 RNA核酸檢測試劑盒。

本發明的試劑盒基于反轉錄重組聚合酶擴增(RT-RPA)和CRISPR一體化反 應，能夠實現對新冠病毒RNA的逆轉錄恒溫擴增和CRISPR的一體化、可視化檢 測。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明提供一種基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試 劑盒，包括兩個部分：反轉錄重組聚合酶擴增(RT-RPA)體系和CRISPR切割體 系，兩者在反應前物理分隔成溶液不連通的兩部分。

在RT-RPA擴增完成后將反轉錄重組聚合酶擴增(RT-RPA)體系和CRISPR 切割體系混勻，混勻體系中的各試劑濃度稱為工作濃度。

進一步地，反轉錄重組聚合酶擴增(RT-RPA)體系的體積盡可能不小于混勻 后總反應體積的4/5，CRISPR切割體系的體積盡可能不大于混勻后總反應體積的 1/5。

進一步地，以25uL總反應體積為例，RT-RPA體系的體積為20-25uL，CRISPR 切割體系的體積不大于5uL。

進一步地，RT-RPA體系中含有RPA酶凍干粉，rehydration RPA buffer，NEBbuffer 2.1，反轉錄酶，RNase inhibitor，醋酸鎂，引物，模板。

進一步地，CRISPR切割體系中含有Cas12a酶，向導RNA(crRNA)，單鏈 DNA熒光猝滅探針(ssDNA熒光猝滅探針)。