[發明專利]基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010973070.0
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN112239795A
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 李富友;王瑞;徐明
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系在反應前物理分隔成溶液不連通的兩部分；所述檢測試劑盒使用時，RT-RPA擴增完成后，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系混勻，混勻體系中的各試劑濃度稱為工作濃度。

2.根據權利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，反轉錄重組聚合酶擴增體系的體積不小于混勻后總反應體積的4/5，CRISPR切割體系的體積不大于混勻后總反應體積的1/5。

3.根據權利要求2所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，對于25uL總反應體積，反轉錄重組聚合酶擴增體系的體積為20-25uL，CRISPR切割體系的體積不大于5uL。

4.根據權利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，反轉錄重組聚合酶擴增體系中含有RPA酶凍干粉，rehydration RPA buffer，NEBbuffer 2.1，反轉錄酶，RNase inhibitor，醋酸鎂，引物，模板；

CRISPR切割體系中含有Cas12a酶，向導RNA，單鏈DNA熒光猝滅探針。

5.根據權利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系混勻后的混勻體系體積為25uL時，

(1)RPA酶凍干粉和rehydration RPA buffer的工作濃度均為1x；

(2)反轉錄酶的添加量為0.5uL-1uL；

(3)NEB buffer 2.1的添加量為2uL；

(4)醋酸鎂將總反應體系中的鎂離子工作濃度補足至10-14mM；

(5)RNase inhibitor的添加量為4-10unit；

(6)引物的工作濃度為0.1-0.5uM；

(7)Cas12a酶的工作濃度為0.1-0.5uM；

(8)向導RNA的工作濃度為Cas12a酶工作濃度的1-10倍，向導RNA的工作濃度為0.1-5uM；

(9)單鏈DNA熒光猝滅探針的工作濃度為0.2uM-1uM。

6.根據權利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，RT-RPA引物序列為：

SARS-CoV-2F:ATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGG；

SARS-CoV-2R:GAAGGACATAAGATGATAGCCCTTTCCACAAAAA。

7.根據權利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，向導RNA序列為：GAAUUUCUACUGUUGUAGAU-GUAGCAGCAAGAUUAGCAGAAGCU。

8.根據權利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，單鏈DNA熒光猝滅探針序列為：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ。

9.根據權利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系物理分隔的方式為：將反轉錄重組聚合酶擴增體系置于管底部，CRISPR切割體系置于管蓋內。

10.根據權利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可視化新冠病毒RNA核酸檢測試劑盒，其特征在于，反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR切割體系物理分隔的方式為：將反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR體系分別置于兩個相連的管中。