[發明專利]一種定量檢測轉基因大豆ZH10-6的特異性引物及方法

在審

• 申請號: 202010972528.0
• 申請日: 2020-09-16
• 公開（公告）號: CN111876522A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 趙新;王一衡;劉雙;尉萬聰;蘭青闊;王永
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明公開了一種定量檢測轉基因大豆ZH10?6的特異性引物，它是采用一對特異性的引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，并在PCR反應體系中添加熒光標記的探針對PCR反應過程進行實時監測，在60℃左右對核酸進行擴增，通過稀釋標準品制作標準曲線，利用內參校正轉基因耐除草劑大豆ZH10?6轉化體序列的百分含量，對未知樣品進行相對定量檢測。其結果鑒定采用擴增曲線是否起峰及起峰的循環數判斷擴增與否，利用標準品制作的標準曲線相對定量未知樣品百分含量。本發明的檢測方法具有高特異性、高靈敏度、快速、簡便等優點，為轉基因耐除草劑大豆ZH10?6的定量檢測提供了可行的方法。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別是涉及一種轉基因產品的檢測方法，具體說是一種基于實時熒光PCR的定量檢測轉基因大豆ZH10-6的方法，通過標準品制作標準曲線，利用內源基因校正外源種屬特異性基因對轉基因耐除草劑大豆ZH10-6轉化體序列進行定量檢測的方法。

背景技術

根據農業生物技術應用國際服務組織ISAAA最新統計顯示，2018年全球有26個國家種植了1.917億hm²轉基因作物，其中轉基因大豆以9590萬hm²種植面積居首，占全球轉基因作物種植面積的50%；從單一作物的種植面積來看，2018年轉基因大豆的應用率為78%；共有31個國家/地區批準了38個轉基因大豆轉化體，主要包括GTS 40-3-2、MON89788、A2704-12、MON88017等轉化體。中國是巴西大豆的主要出口市場，在2018年，巴西80%的大豆出口到中國，出口總額預計達到830億kg，創歷史新高。而轉基因大豆的研發在國內外均占據舉足輕重的地位。

轉基因耐草甘膦大豆ZH10-6是由中國農業科學院作物科學研究所研發的轉G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草劑大豆新品系。研發人采用農桿菌介導轉化法，將整合有G2-EPSPS和GAT兩個基因的獨立表達載體DNA導入大豆受體中，通過多代篩選獲得對草甘膦具有抗性的ZH10-6轉化體，在中國具有重要產業化應用前景。

基于Taqman水解探針的實時熒光PCR方法，是指通過特異性的引物擴增目的基因序列，通過在體系中添加熒光標記的水解探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步，從而實現對反應過程的實時監測。

相對于轉基因成分定性PCR檢測方法，實時熒光定量PCR檢測方法不僅可以檢測出產品含有的轉基因成分，而且可以相對定量出所含轉基因成分的含量，更加有利于轉基因產品的管理。目前，多種轉基因植物均有其實時熒光PCR檢測方法，例如李蔥蔥等建立了轉基因玉米Bt176的實時熒光定量檢測方法；汪秀秀等建立了針對轉基因棉花GHB119品系的特異性實時熒光PCR定量檢測方法。

中國已經研制了ZH10-6大豆的定性PCR檢測方法標準，但是其實時熒光定量PCR方法未見報道，建立本轉基因耐除草劑大豆ZH10-6實時熒光定量PCR檢測方法，以便對轉基因大豆ZH10-6轉化體進行定量研究。本研究以ZH10-6轉化體特異性序列為靶標，依據相關技術要求，建立了基于Taqman水解探針的實時熒光定量PCR檢測方法，將對該轉化體的安全評價、行政監管和知識產權保護提供重要的技術支撐。

發明內容

本發明克服了普通PCR檢測轉基因大豆ZH10-6只能定性不能定量的技術缺陷，提供一種定量檢測轉基因大豆ZH10-6的方法。本發明的目的是解決定量檢測轉基因大豆ZH10-6方法空缺的問題，具有簡單易行、靈敏度高、特異性強、穩定的優點。

本發明的技術內容如下：