[發(fā)明專利]一種定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6的特異性引物及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010972528.0
• 申請(qǐng)日: 2020-09-16
• 公開（公告）號(hào): CN111876522A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙新;王一衡;劉雙;尉萬(wàn)聰;蘭青闊;王永
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6的特異性引物，其特征在于包括ZH10-6的第二個(gè)5’端外源基因插入側(cè)翼的序列如下：

正向引物序列：5’- CAAATCCTATGGGCATTCTTCC -3’

反向引物序列：5’- CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’

探針序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1

內(nèi)源基因Lectin基因序列：

正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

探針序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1。

2.一種采用權(quán)利要求1所述的特異性引物進(jìn)行快速定量檢測(cè)方法，其特征在于如下步驟：

（1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性引物，其特征在于

正向引物序列：5’-CAAATCCTATGGGCATTCTTCC-3’,

反向引物序列：5’- CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’，

探針序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1；

內(nèi)源基因Lectin基因序列：

正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’，

反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’，

探針序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；

（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，包括TaKaRa 2×Premix Ex Taq (probeqPCR) 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L) 0.5 μL，DNA模板(25 ng/μL) 2 μL, 用無菌水補(bǔ)充至20 μL；

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min, 1個(gè)循環(huán)；95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 40個(gè)循環(huán)；

（4）構(gòu)建轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6轉(zhuǎn)化體序列定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)參照物，提取轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6的基因組DNA后，進(jìn)行梯度稀釋，分別得到100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.0064%、0.00128%8個(gè)濃度的DNA，利用8個(gè)濃度梯度的DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6轉(zhuǎn)化體特異性序列和內(nèi)源基因Lectin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（5）設(shè)定閾值后，熒光定量PCR儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的Ct值和靶標(biāo)濃度，并記錄，按照公式A=B/[B+(C-B)/D]×100%，計(jì)算出試樣中轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6轉(zhuǎn)化體序列百分含量，式中A為轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6轉(zhuǎn)化體序列百分含量，B為轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6轉(zhuǎn)化體序列的靶標(biāo)濃度，C為Lectin內(nèi)源基因的靶標(biāo)濃度，D為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6成分中摻入非轉(zhuǎn)基因大豆成分的校正系數(shù)，即為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6基因組大小/摻入非轉(zhuǎn)基因大豆基因組大小。

3.權(quán)利要求1所述定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6的特異性引物在用于ZH10-6快速定量高效篩查方面的應(yīng)用。