[發(fā)明專利]一種牙鲆彈狀病毒病感染態(tài)與免疫態(tài)的快速診斷試紙

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010972037.6
• 申請(qǐng)日: 2020-09-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112098658A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐小千;戰(zhàn)文斌;龔嬌嬌;繩秀珍;邢婧;遲恒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

1.一種牙鲆彈狀病毒病感染態(tài)與免疫態(tài)的快速診斷試紙，包括載體板、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述樣品墊和吸水墊位于所述載體板的兩端，所述硝酸纖維素膜位于所述載體板的中部；所述樣品墊與硝酸纖維素膜交界處設(shè)有載有金標(biāo)鼠抗牙鲆免疫球蛋白單克隆抗體的金標(biāo)墊，所述金標(biāo)墊一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜之上，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有依次排列的兩條檢測(cè)線T2、T1和一條質(zhì)控線C，所述質(zhì)控線C靠近吸水墊；其特征在于，所述檢測(cè)線T1包被重組純化的牙鲆彈狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，所述檢測(cè)線T2包被重組純化的牙鲆彈狀病毒基質(zhì)蛋白，所述質(zhì)控線C包被有羊抗小鼠IgG。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速診斷試紙，其特征在于所述重組純化的牙鲆彈狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，能特異性結(jié)合感染牙鲆彈狀病毒的牙鲆血清抗體，不能結(jié)合免疫牙鲆彈狀病毒的牙鲆血清抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速診斷試紙，其特征在于所述重組純化的牙鲆彈狀病毒基質(zhì)蛋白為牙鲆彈狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，能特異性結(jié)合感染牙鲆彈狀病毒得牙鲆血清抗體和免疫牙鲆彈狀病毒的牙鲆血清抗體。

4.一種如權(quán)利要求1所述牙鲆彈狀病毒病感染態(tài)與免疫態(tài)的快速診斷試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）鼠抗牙鲆免疫球蛋白單克隆抗體的腹水生產(chǎn)與純化：

復(fù)蘇并培養(yǎng)分泌抗牙鲆免疫球蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株JF-IgM-H，腹腔注射BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸-硫酸銨法提純獲得單抗；

（2）牙鲆彈狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和牙鲆彈狀病毒基質(zhì)蛋白的制備與純化：

通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳、間接免疫熒光，選定牙鲆彈狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和牙鲆彈狀病毒基質(zhì)蛋白，通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)和His標(biāo)簽蛋白純化技術(shù)制備抗原以及牙鲆彈狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白多克隆抗體和牙鲆彈狀病毒基質(zhì)蛋白單克隆抗體；

（3）金標(biāo)墊的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制成顆粒大小為20 -30 nm的膠體金，再以碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金pH值為8.2；將抗牙鲆免疫球蛋白單抗加入膠體金中，再加入牛血清白蛋白，離心純化后用金標(biāo)保存液懸起，即為金標(biāo)單抗液體；將制成的金標(biāo)單抗液體噴涂到玻璃纖維上，冷凍干燥，即為載有金標(biāo)單抗的金標(biāo)墊；

（4）硝酸纖維素膜的制備

分別將一定濃度的純化牙鲆彈狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和牙鲆彈狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基質(zhì)蛋白按照一定間距和順序噴涂于硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線T1、T2，將羊抗小鼠IgG噴涂于硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，晾干，于封閉液中浸泡，PBST漂洗，干燥；

（5）牙鲆彈狀病毒感染態(tài)與免疫態(tài)快速診斷試紙的制作

在載體板上依次貼上硝酸纖維素膜、吸水墊、金標(biāo)墊和樣品墊，放入切條機(jī)槽內(nèi)切割成3.7 mm寬的試紙，將切好的試紙放入裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)封口，裝入包裝卡殼，密封于鋁箔袋中保藏，即為本發(fā)明試紙。