[發明專利]一種利用KASP標記鑒定亞洲棉的花基紅斑性狀的方法

有效

• 申請號: 202010969065.2
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112301143B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 張建宏;張素君;張香云;劉存敬;唐麗媛;李興河;王海濤;蔡肖
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院棉花研究所（河北省農林科學院特種經濟作物研究所）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京中海智圣知識產權代理有限公司 11282
• 代理人: 曾永珠

本發明公開了一種利用KASP標記鑒定亞洲棉的花基紅斑性狀的方法。所述方法包括以下步驟：步驟1，提取亞洲棉基因組DNA；步驟2，開發亞洲棉花基紅斑KASP標記；步驟3，KASP基因分型，KASP?PCR反應在Douglas Array Tape平臺上進行；步驟4，KASP分子標記判定花基紅斑性狀。本發明所述方法的每個KASP標記判定準確率在92％以上，5個KASP標記同時進行判定，判定效率在96％以上?？蛇_到早期鑒定花基顏色的目的。

技術領域

本發明涉及棉花分子育種應用領域，具體而言，涉及一種利用KASP標記鑒定亞洲棉的花基紅斑性狀的方法。

背景技術

我國種植亞洲棉有兩千年以上的歷史，亞洲棉具有早熟、耐旱、抗病蟲等特點，且易種、好管、蟲害少，亞洲棉纖維粗短、強力高，既適于制作棉被和土布，又適于織燈芯絨、拉絨布、混紡地毯。且亞洲棉花色多樣，顏色絢麗，極具觀賞價值，在庭院花園興起后，其綜合價值將進一步凸顯?；ɑt斑性狀指當亞洲棉的花蕾盛開后，花瓣為乳白色，而花瓣底端有深紅色花斑，該性狀顏色艷麗，易于分辨，直到花瓣凋謝干枯時花斑仍能清晰分辨。

現有技術中，利用具有花基紅斑性狀的純系品種和不具有花基紅斑性狀的品種雜交，可根據花基紅斑的比例鑒別雜交種真偽和純度，即花基紅斑性狀可作為指示性狀用于雜交棉真偽和純度檢驗。

例如中國專利公開號為CN102057862A的發明專利公開了一種陸地棉花基紅斑標記性狀的應用，其是使用具有花基紅斑標記性狀的雜交棉親本或純系品種作為父本或母本，與具有或不具有花基紅斑標記性狀的其它雜交棉親本和純系品種進行雜交，生產雜交種，生產的雜交種播種后，根據花基紅斑的比例直觀鑒別和檢驗雜交種真偽和純度；所述的具有花基紅斑標記性狀的雜交棉親本包括兩系不育系、三系不育系、保持系和恢復系。該發明可以有效控制棉花種子生產質量，避免假冒偽劣和純度差的種子沖擊市場，為生產、銷售合格種子提供技術支撐和保護，以維護企業和農民的合法權益，促進棉種產業的健康發展，具有很高的應用價值。

現有技術中至少存在以下問題：

由于亞洲棉從播種到開花至少需要兩個月，且開花還受季節、光照和溫度影響，作為指示性狀無法達到早期預測的目的。因此，借助分子標記技術，尋找一種利用種子或者幼苗鑒定亞洲棉花基紅斑的方法，對該性狀在雜交種真實度和純度鑒定上的應用具有重要意義。

針對現有技術中由于亞洲棉從播種到開花至少需要兩個月，且開花還受季節、光照和溫度影響，作為指示性狀無法達到早期預測的目的的問題，目前尚未提出有效的解決方案。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種利用KASP標記鑒定亞洲棉花基紅斑性狀的方法。

所述方法包括以下步驟：

步驟1，獲取亞洲棉基因組DNA：

步驟1.1，提取，將亞洲棉置于液氮預冷的2ml離心管中，放入2顆直徑8mm小鋼珠，加入750ml的CTAB提取液，用轉速1800r/min的研磨機研磨8min，取出后，置于冰上放置5min；

步驟1.2，裂解，利用離心機在4℃下12000r/min離心15min，將離心管傾斜流出上部液體，棄上清，取出1顆鋼珠，加入750ml裂解液，將離心管置于泡沫浮漂上在65℃水浴30-45min，每5min晃動離心管15s；

步驟1.3，抽提，冷卻至室溫，加入等量氯仿/異戊醇(24:1)輕緩顛倒混勻，5000r/min離心15min，取上清，并重復再抽提一次；

步驟1.4，沉淀，將異丙醇在-20℃冰箱中預冷2小時，取步驟1.3中上清液2/3體積的異戊醇分裝到1.5ml離心管中，將上清液注入異戊醇中，顛倒混勻，在-20℃冰箱靜置20min，當出現白色絮狀沉淀時，10000r/min離心10min，傾斜離心管，棄上清液；