[發明專利]一種利用KASP標記鑒定亞洲棉的花基紅斑性狀的方法

有效

• 申請號: 202010969065.2
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112301143B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 張建宏;張素君;張香云;劉存敬;唐麗媛;李興河;王海濤;蔡肖
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院棉花研究所（河北省農林科學院特種經濟作物研究所）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京中海智圣知識產權代理有限公司 11282
• 代理人: 曾永珠

1.一種利用KASP標記鑒定亞洲棉的花基紅斑性狀的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，獲取亞洲棉基因組DNA：

步驟1.1，提取，將亞洲棉置于液氮預冷的2ml離心管中，放入2顆直徑8mm小鋼珠，加入750ml的CTAB提取液，用轉速1800r/min的研磨機研磨8min，取出后，置于冰上放置5min；

步驟1.2，裂解，利用離心機在4℃下12000r/min離心15min，將離心管傾斜流出上部液體，棄上清，取出1顆鋼珠，加入750ml裂解液，將離心管置于泡沫浮漂上在65℃水浴30-45min，每5min晃動離心管15s；

步驟1.3，抽提，冷卻至室溫，加入等量氯仿/異戊醇(24:1)輕緩顛倒混勻，5000r/min離心15min，取上清，并重復再抽提一次；

步驟1.4，沉淀，將異丙醇在-20℃冰箱中預冷2小時，取步驟1.3中上清液2/3體積的異戊醇分裝到1.5ml離心管中，將上清液注入異戊醇中，顛倒混勻，在-20℃冰箱靜置20min，當出現白色絮狀沉淀時，10000r/min離心10min，傾斜離心管，棄上清液；

步驟1.5，清洗，向離心管內加入70％乙醇，震動離心管下部，將附著在離心底的DNA沉淀彈起并晃動離心管，置于離心機中，5000r/min離心1min，傾斜離心管棄上清，利用70％乙醇重復洗滌沉淀2次，100％乙醇清洗1次，置于通風櫥風干；

步驟1.6，定容，將風干后的DNA沉淀溶于30-40ul超純水中，加入核糖核酸酶，常溫放置1h，后置于4℃冰箱備用；

步驟2，開發亞洲棉花基紅斑KASP標記：

步驟2.1，對25個非同義突變位點和3個移碼突變位點在花基紅斑分離群體中進行檢測，其中，有5個位點與花基紅斑性狀緊密連鎖，分別命名為Ga27640-C/CAA,Ga27640-T/G,Ga27646-A/G,Ga27648-A/T,Ga27650-C/G；

步驟2.2，針對步驟2.1中與花基紅斑性狀緊密連鎖的5個位點分別進行KASP標記開發，利用Primer3根據SNP位點設計PCR3’末端擴增引物，引物Tm值在55～65℃之間，每個SNP位點設計兩條SNP特異性引物和一條通用引物；

步驟3，KASP基因分型，KASP-PCR反應在Douglas Array Tape平臺上進行：

步驟3.1，在NEXAR液體處理工作站上DNA和PCR mix加入array tape，在SOELLEX高通量PCR水浴中完成PCR反應；

步驟3.1.1，PCR反應成分包括Master Mix和引物Mix：

Master Mix包括：FAMTM和HEXTM特殊熒光共振能量轉移基團、經過修飾的Taq酶，用于擴增等位特異堿基和反應緩沖液；

引物Mix包括：兩條正向序列等位特異引物，每條引物5’-端都含有一段未經過熒光標記的接頭序列和一條反向序列引物；

步驟3.1.2，PCR反應體系：

DNA分裝到PCR反應容器后，LGC平臺將分裝好的DNA在烘箱65℃放置30min進行烘干；

步驟3.1.3，PCR反應程序：

步驟3.1.3.1，在94℃的溫度下進行變性，變性時間為15mins；

步驟3.1.3.2，富集含有SNP位點的模板DNA，在94℃的溫度下進行變性，變性時間為20s,在55-61℃的溫度下進行退火/延伸，60S梯度退火，每個循環降低0.6℃，重復10個循環；

步驟3.1.3.3，熒光信號放大，在94℃的溫度下進行變性，變性時間為20s,在55℃的溫度下進行退火/延伸，60S梯度退火，重復26個循環；

步驟3.2，ARAYA熒光閱讀儀上讀取熒光信號，當KASP檢測PCR反應程序完成時，將384孔板和Tape分別放置到Omega熒光信號閱讀儀和Araya熒光檢測系統，Araya熒光檢測系統將熒光信號轉變為堿基基因型，并采用KrakenTM進行基因型分析；

步驟3.3，將熒光信號結果導入數據庫在Douglas Scientific Dashboard，按照分型明確、NTC無特異性擴增的原則進行樣品SNP分型；

步驟4，KASP分子標記判定花基紅斑性狀：

標記Ga27640-C/CAA，檢測位點位置為Chr01-118444577，FAM引物序列為AGCTGTATATCCCGGGGTTTTTTTG，VIC引物序列為GAGCTGTATATCCCGGGGTTTTTTTT，COM引物序列為CTTTGGAGCTGCATCCGGAAATGTT，若檢測位點基因型為CAA/CAA，則為無花基紅斑；若為C/C，則為有花基紅斑純合型；若為C/CAA，則為有花基紅斑雜合型；

標記Ga27640-T/G，檢測位點位置為Chr01-118445602，FAM引物序列為GTAATCTAATCCACGGGCTGCAA，VIC引物序列為TAATCTAATCCACGGGCTGCAC，COM引物序列為CTCCTCTCACCTGGAAACAGAGATT，若檢測位點基因型為G/G，則為無花基紅斑；若為T/T，則為有花基紅斑純合型；若為G/T，則為有花基紅斑雜合型；

標記Ga27646-A/G，檢測位點位置為Chr01-118637518，FAM引物序列為TACAGTGTTCACCTTTTTTGCTATCAT，VIC引物序列為CAGTGTTCACCTTTTTTGCTATCAC，COM引物序列為TATAATCCTTGCGTCCCAGACCCTA，若檢測位點基因型為G/G，則為無花基紅斑；若為A/A，則為有花基紅斑純合型；若為A/G，則為有花基紅斑雜合型；

標記Ga27648-A/T，檢測位點位置為Chr01-118729707，FAM引物序列為AGCTATTTCAATGGAAACCAACAGCA，VIC引物序列為AGCTATTTCAATGGAAACCAACAGCT，COM引物序列為CTCCAATTGTTCGTCGTTGGCGATA，若檢測位點基因型為T/T，則為無花基紅斑；若為A/A，則為有花基紅斑純合型；若為A/T，則為有花基紅斑雜合型；

標記Ga27650-C/G，檢測位點位置為Chr01-118736807，FAM引物序列為GTGGTCCAACATTTGTCGAGGTG，VIC引物序列為GTGGTCCAACATTTGTCGAGGTC，COM引物序列為GAAGAGCAACACCAGTTACGAGTGTA，若檢測位點基因型為G/G，則為無花基紅斑；若為C/C，則為有花基紅斑純合型；若為C/G，則為有花基紅斑雜合型。

2.根據權利要求1所述的利用KASP標記鑒定亞洲棉的花基紅斑性狀的方法，其特征在于，步驟3.1.1所述PCR反應成分包括Master Mix和引物Mix中，反應緩沖液由以下重量份數的原料組成：

dNTp混合物10份；

氯化鎂溶液4份；

DNA聚合酶3份；

Taq酶3份；

三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽5份；

三氮化鈉4份；

去離子水10份；

甘油2份；

氯化鎂4份；

醋酸鉀3份；

二硫蘇糖醇4份；

硫酸銨5份。