[發明專利]源自雞蛋的熱啟動酶及阻斷活性的評價方法

在審

• 申請號: 202010964397.1
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112063600A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 烏拉迪斯拉夫
• 申請（專利權）人: 諸暨加向生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C07K16/40;C07K16/02;C12Q1/686;C12Q1/6804;C12Q1/70;C12R1/93
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本發明公開了一種源自雞蛋的熱啟動酶及其阻斷活性的方法，所述的熱啟動酶，包括Taq聚合酶以及源自雞卵黃免疫球蛋白的抗體IgY。本發明選擇衍生自雞蛋的多克隆抗體IgY結合Taq聚合酶，實現了對于熱啟動IgY不會抑制聚合酶活性，而是可逆地阻止它，且價格低廉，適于大面積推廣。

技術領域

本發明涉及一種源自雞蛋的熱啟動酶及其阻斷活性的評價方法。

背景技術

熱啟動可以大大提高PCR的特異性，靈敏度和產率。在室溫下制備反應混合物時，PCR中會發生非特異性擴增，因為Taq聚合酶具有活性，引物可以非特異性雜交。 熱啟動Taq聚合酶在室溫下保持無活性，并在95°C加熱后被激活，從而防止了非特異性擴增。 針對Taq聚合酶的單克隆抗體是用于將常規Taq聚合酶打開為熱啟動試劑的第一線試劑。

蛋黃衍生的抗體（IgY）是眾所周知的最便宜的來源，其質量與哺乳動物IgG抗體相同，并且比過去有一些突出的優勢。 與IgY的開發和使用相關的這些優勢包括對哺乳動物抗原的更好的免疫應答，與持續效價的更高親和力，無創采樣，簡單且低成本的分離過程，高產量和可擴展的生產性。 自1996年以來，IgY技術已成為描述IgY生產和使用的國際公認術語。 歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）研討會建議使用IgY代替哺乳動物IgG，以最大程度地減少有創抗體采樣引起的痛苦，并促進雞IgY的更廣泛實施，因為這種方法滿足了科學和商業利益 以及對動物福利的關注。

Taq DNA聚合酶的單克隆抗體是聚合酶鏈反應（PCR）中的核心酶，在環境溫度下會使其失活。 在隨后的加熱中，反應混合物引起聚合酶的活化，并且擴增以特定且有效的方式進行。 這就是抗體介導的所謂熱啟動PCR。 對于復雜DNA背景中低拷貝數模板的可靠檢測，它尤其有用。 但是最近的研究表明，許多商業上以“熱啟動”形式銷售的Taq酶制劑在熱激活之前就表現出聚合酶活性。 許多熱啟動酶不能按預期發揮作用具有深遠的意義。

如何生產和評估一種價格低廉、有效的熱啟動酶是本領域技術人員研究的對象。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，通過使用單克隆抗體作為熱啟動試劑來解決上述問題，并提出研究使用多克隆抗體的可行性。 選擇的模型是衍生自雞蛋的多克隆抗體IgY。

一種源自雞蛋的熱啟動酶，所述的熱啟動酶，包括Taq 聚合酶以及源自雞卵黃免疫球蛋白的抗體IgY。

一種源自雞蛋的熱啟動酶制備方法：

步驟一：將兩只20周大的母雞關在籠子里，進食和飲水，用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中進行混合，形成混合液，混合液在相同體積的弗氏完全佐劑（FCA）中乳化，用于首次針對母雞注射，而后混合液在相同體積的弗氏不完全佐劑（FIA）中乳化又進行兩次注射，實現免疫接種；

步驟二：每隔10天進行步驟一條件下的注射；

步驟三：在3個月內每月進行一次弗氏不完全佐劑（FIA）的免疫接種，每天收集雞蛋；

步驟四：完成步驟三的雞蛋黃中分離IgY的第一步涉及從脂質和脂蛋白中提取可溶性蛋白，該方案包括在0.1％（w / v）的柑橘果膠水溶液中通過5倍稀釋的蛋黃沉淀不溶物；

步驟五：通過用35％（w / v）硫酸銨混合經過步驟一的蛋黃沉淀不溶物，飽和沉淀出水溶性蛋白質（包括IgY）

步驟六：為了親和步驟二的水溶性蛋白質，以瓊脂糖凝膠4B為基質，以Taq聚合酶作為配體相結，獲得熱啟動酶。

作為優選方法，以0.1 ml / min的流速將總水溶性蛋白質在PBS中稀釋至1.0 mg/ ml，并加到在磷酸緩沖鹽溶液中平衡的以瓊脂糖凝膠4B為基質的Taq聚合酶形成的親和樹脂，直到流槽A280的光密度達到基本水平，獲得熱啟動酶。