[發(fā)明專利]源自雞蛋的熱啟動(dòng)酶及阻斷活性的評(píng)價(jià)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010964397.1
• 申請(qǐng)日: 2020-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN112063600A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 烏拉迪斯拉夫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 諸暨加向生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C07K16/40;C07K16/02;C12Q1/686;C12Q1/6804;C12Q1/70;C12R1/93
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1.一種源自雞蛋的熱啟動(dòng)酶，其特征在于：所述的熱啟動(dòng)酶，包括Taq 聚合酶以及源自雞卵黃免疫球蛋白的抗體IgY。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的源自雞蛋的熱啟動(dòng)酶制備方法：

步驟一：將兩只20周大的母雞關(guān)在籠子里，進(jìn)食和飲水，用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中進(jìn)行混合，形成混合液，混合液在相同體積的弗氏完全佐劑（FCA）中乳化，用于首次針對(duì)母雞注射，而后混合液在相同體積的弗氏不完全佐劑（FIA）中乳化又進(jìn)行兩次注射，實(shí)現(xiàn)免疫接種；

步驟二：每隔10天進(jìn)行步驟一條件下的注射；

步驟三：在3個(gè)月內(nèi)每月進(jìn)行一次弗氏不完全佐劑（FIA）的免疫接種，每天收集雞蛋；

步驟四：完成步驟三的雞蛋黃中分離IgY的第一步涉及從脂質(zhì)和脂蛋白中提取可溶性蛋白，該方案包括在0.1％（w / v）的柑橘果膠水溶液中通過5倍稀釋的蛋黃沉淀不溶物；

步驟五：通過用35％（w / v）硫酸銨混合經(jīng)過步驟一的蛋黃沉淀不溶物，飽和沉淀出水溶性蛋白質(zhì)（包括IgY）

步驟六：為了親和步驟二的水溶性蛋白質(zhì)，以瓊脂糖凝膠4B為基質(zhì)，以Taq聚合酶作為配體相結(jié)，獲得熱啟動(dòng)酶。

3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的源自雞蛋的熱啟動(dòng)酶制備方法：以0.1 ml / min的流速將總水溶性蛋白質(zhì)在PBS中稀釋至1.0 mg / ml，并加到在磷酸緩沖鹽溶液中平衡的以瓊脂糖凝膠4B為基質(zhì)的Taq聚合酶形成的親和樹脂，直到流槽A280的光密度達(dá)到基本水平，獲得熱啟動(dòng)酶。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的源自雞蛋的熱啟動(dòng)酶制備方法：用0.1 M甘氨酸緩沖液（pH2.3）洗脫結(jié)合的熱啟動(dòng)酶并分離，加入相同體積的0.2 M磷酸鈉緩沖液（pH 8.0）中和洗脫的熱啟動(dòng)酶，合并洗脫的分離，并在磷酸緩沖鹽溶液中透析過夜獲得熱啟動(dòng)酶。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求1至2任一所述源自雞蛋的熱啟動(dòng)酶阻斷活性的評(píng)價(jià)方法：

步驟一：配制兩種預(yù)混液：熱啟動(dòng)酶 PCR預(yù)混液和逆轉(zhuǎn)錄抗體PCR預(yù)混液，每個(gè)預(yù)混液均包含Taq聚合酶緩沖液，Taq聚合酶緩沖液包括50 mM Tris-HCl，pH 9.9，50 mM KCl，3 mMMgCl2，1 mM DTT，1 mM EDTA，將兩種預(yù)混液用5％海藻糖和0.5％聚乙二醇作為冷凍保護(hù)添加劑凍干；

步驟二：使用從疫苗菌株中分離出總豬瘟病毒，逆轉(zhuǎn)錄抗體 PCR預(yù)混液首先使用來自鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體引物3μg在Taq緩沖液中于42℃進(jìn)行20分鐘的逆轉(zhuǎn)錄PCR 5μl豬瘟病毒（20 ng），然后在95℃失活10分鐘，使用以下循環(huán)條件：95℃ 2分鐘；在20μl熱啟動(dòng)酶主混合物中擴(kuò)增5μlcDNA（1000、250和62個(gè)拷貝），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，40個(gè)循環(huán)包括95℃熱啟動(dòng)持續(xù)10 s和58℃持續(xù)20 s，在每個(gè)循環(huán)之后在58℃下在ROX通道發(fā)射610nm，并記錄數(shù)據(jù)；

步驟三：對(duì)于熱啟動(dòng)酶 PCR預(yù)混液，將5μl豬瘟病毒直接加入一管抗體PCR Master Mix中，并在以下條件下運(yùn)行：42 ℃進(jìn)行20分鐘； 95 ℃ 2分鐘； 40個(gè)循環(huán)包括95 ℃持續(xù)10 s和58 ℃持續(xù)20 s，在每個(gè)循環(huán)之后在58℃下在ROX通道發(fā)射610nm，并記錄數(shù)據(jù)。