[發明專利]腦脫細胞基質顆粒支架及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010963615.X
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112029727A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 王燦;李文斌;崔磊;李曉玉;李生蘭;于春娜;彭怡琛;陳錦益
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京天壇醫院;首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/0793;C12N5/09
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了腦脫細胞基質顆粒支架及其制備方法和應用。本發明所構建的腦脫細胞基質顆粒支架脫除細胞完全，核酸殘留少，未經過酶的消化處理等能部分保存原有腦基質的生物成分，能模擬體內腦細胞生長的細胞外基質微環境，使培養的腦細胞的生物學特性更接近在體生長的腦細胞；將脫細胞的腦組織以顆粒的形式涂敷于各種細胞培養容器表面，能改善實驗的重復性和可觀測性，顯著降低了材料的厚度，同時其顆粒的形式又增加了材料的透光性，方便于在倒置光學顯微鏡下動態觀察活細胞的增殖、形態等各種生物學現象。本發明腦脫細胞基質顆粒支架適用腦細胞與ECM以及腦細胞之間互相作用機制研究，也能應用于腦相關疾病的藥物篩選。

技術領域

本發明涉及脫細胞腦組織材料，尤其涉及腦脫細胞基質顆粒支架及其制備方法和應用，屬于腦脫細胞基質顆粒支架領域。

背景技術

細胞生存的微環境是指細胞外基質及其中的體液成分，微環境的完整和穩定是細胞正常增殖、分化、代謝和功能活動所必須的，微環境成分的異常變化可使細胞各種生物特征異常。然而，目前生命科學領域相關的基礎科研中使用的細胞培養載體仍然是缺乏細胞外基質的普通塑料培養皿(瓶)。這種培養模式形成的培養物，其分子表型結構單一或者隨著傳代次數的增加越來越單一，難以模擬體內細胞真實的生物學特征，因此急需新的培養模式及培養載體。

細胞外基質是由生物大分子構成的錯綜復雜的網絡，構成細胞外基質的大分子種類繁多，可大致歸納為四大類：膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖以及彈性蛋白。細胞外基質的組分及組裝形式由所產生的細胞決定，并與組織的特殊功能需要相適應。與身體其他組織相比，腦組織中的細胞外基質成分非常特殊，以蛋白聚糖和糖胺聚糖為主，膠原含量極少。因此也有著其自身特有的功能，其為腦細胞(神經元、神經膠質細胞、腫瘤細胞以及其他細胞)的生存及活動提供適宜的場所并通過與細胞膜上受體結合影響神經元和神經膠質的代謝、功能、遷移、突觸的引導、增殖和分化等生物學過程。隨著組織工程和生物材料科學的發展，生物材料類的細胞培養載體種類也越來越多，腦脫細胞基質就是其中之一。大腦的脫細胞是一個非常成熟的技術，其主要目的是利用化學試劑去除大腦中的細胞成分，盡可能的保存其原有機械性能、ECM成分、各種細胞因子等。

目前脫細胞腦組織材料在科研中主要有以下應用方式：①切成小塊后滅菌(或者提前凍干)接種細胞進行三維細胞培養。這種方式的優點在于最大可能的模擬了體內微環境的組織結構和細胞外基質成分。但它卻有著難以推廣的缺點：a.透光差，無法進行活細胞狀態觀察；b.細胞接種后在支架內分布不均勻及細胞丟失，導致實驗重復性差；c.支架尺寸形狀及重量缺乏科學的標準；②用胃蛋白酶等酶消化成多肽混合物，制成水凝膠后接種細胞進行三維培養。這種方式的優點在于：a.能控制水凝膠中細胞外基質的濃度；b.形狀能兼容多種培養容器；c.透光性非常好，能在活細胞狀態下觀察培養物的變化。但它也有著明顯的缺點：a.由于經過酶的消化，許多有活性的生物大分子都會失去活性或者原本活性低的大分子活性大增，同時組織的天然結構會被徹底破壞，從而失去原有ECM成分所具有的生物學功能；b.由于腦組織膠原蛋白等成膠分子含量低，制作水凝膠時往往額外引入其他成膠成分，破壞了該水凝膠基質的“原位天然性”；c.成膠過程需要較長時間的溫箱孵育，此過程細胞下沉導致細胞在垂直方向上分布不均勻；③用胃蛋白酶等酶消化成多肽混合物或者浸泡形成浸出液，包被培養容器進行二維培養。這種培養方式的優點與水凝膠相似，只是其不能提供三維培養空間。但是，其缺點也與水凝膠相似，只是不需要引入其他成膠成分且細胞能均勻分布。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種更能反應體內細胞生物學特性，又能促進實驗的重復性和可觀測性的腦脫細胞基質顆粒支架；

本發明的目的之二是提供制備所述腦脫細胞基質顆粒支架的方法；

本發明的目的之三是將所述的腦脫細胞基質顆粒支架應用于單獨培養腦細胞或將腦細胞與其它細胞進行共培養。

為實現上述目的，本發明首先提供了一種腦脫細胞基質顆粒支架，其制備方法包括：