[發明專利]腦脫細胞基質顆粒支架及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010963615.X
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112029727A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 王燦;李文斌;崔磊;李曉玉;李生蘭;于春娜;彭怡琛;陳錦益
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京天壇醫院;首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/0793;C12N5/09
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.一種腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，其制備方法包括：

(1)以動物或人的腦組織為材料進行脫細胞處理得到脫細胞腦組織；

(2)將得到的腦脫細胞基質進行冷凍干燥；

(3)將冷凍干燥后的腦脫細胞基質研磨破碎；

(4)將腦脫細胞基質碎塊用去離子水重懸得到腦脫細胞基質懸液，將腦脫細胞基質懸液進行攪拌破碎處理；

(5)腦脫細胞基質顆粒懸液過濾除掉大顆粒基質，濾液涂敷于細胞培養容器的表面后干燥固化；

(6)將干燥固化的涂敷有腦脫細胞基質顆粒懸液的細胞培養容器進行滅菌、干燥，即得。

2.按照權利要求1所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，所述的動物的腦組織中的動物包括大鼠、小鼠或豬。

3.按照權利要求1所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，步驟(1)中所述的以動物或人的腦組織為材料進行脫細胞處理得到脫細胞腦組織中的脫細胞處理方法是完整的脫除細胞，部分保存原有腦基質的基質結構和生物成分。

4.按照權利要求3所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，步驟(1)中所述的以動物或人的腦組織為材料進行脫細胞處理得到脫細胞腦組織中的脫細胞處理方法，包括：

(a)對SD大鼠進行腹主動脈灌流生理鹽水至腦組織變白再進行開顱取腦；

(b)將得到的腦去除小腦，延正中矢狀面及正中冠狀面切開，用1xPBS沖洗一遍后，-80℃與37℃下交替放置30min，凍融四次；

(c)在搖床上，將去除小腦后的腦組織以60rpm的轉速，室溫下用PBS清洗3次，10min/次；

(d)在搖床上，以60rpm，4℃下用1％的Triton-X100處理12h，得到初步脫細胞的腦組織；

(e)在搖床上，將初步脫細胞的腦組織以60rpm，室溫下用去離子水洗3遍，10min/遍；

(f)在搖床上，以60rpm，室溫下用4％的脫氧膽酸鈉處理12h，得到脫細胞的腦組織。

5.按照權利要求4所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，對得到脫細胞的腦組織進行下述的后處理，包括：

(a)在搖床上，將脫細胞的腦組織以60rpm，室溫下用去離子水洗3遍，10min/遍；

(b)在搖床上，以60rpm，室溫下用1M NaCl的DNA酶I處理12min；

(c)在搖床上,以60rpm，室溫下用去離子水洗3遍，10min/遍，放于-80℃冰凍保存。

6.按照權利要求1所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，步驟(2)中所述的冷凍干燥的溫度為-45℃，冷凍干燥時間為12h。

7.按照權利要求1所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，步驟(5)中將腦脫細胞基質顆粒懸液用50-120目細胞篩進行過濾，更優選采用70-100目細胞篩進行過濾，最優選采用100目細胞篩進行過濾；步驟(5)中所述的細胞培養容器包括但不限于細胞培養皿、細胞培養瓶或細胞培養板。

8.按照權利要求1所述的腦脫細胞基質顆粒支架，其特征在于，步驟(6)中將得到的涂敷有腦脫細胞基質顆粒懸液的細胞培養容器采用Co60照射滅菌的方式進行滅菌，所述的照射劑量優選為25Gy；步驟(6)中所述的干燥在4℃條件下進行干燥。

9.按照權利要求1-8任何一項所述的腦脫細胞基質顆粒支架在單獨培養腦細胞或將腦細胞與其它細胞進行共培養中作為培養支架中的應用。

10.按照權利要求9所述的應用，其特征在于，在應用所構建的腦脫細胞基質顆粒支架培養細胞之前，將其用PBS洗3次，1h/次；再用相應的用于培養細胞的完全培養基浸泡過夜。