[發(fā)明專利]一種神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的體外培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010963058.1
• 申請(qǐng)日: 2020-09-14
• 公開（公告）號(hào): CN112080470B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴建武;崔熠;韓津
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/0793
• 分類號(hào): C12N5/0793;C12N5/0797;C08J9/28;C08J9/36;C08L89/00
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供一種神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的體外培養(yǎng)方法，其包括將神經(jīng)干細(xì)胞置于含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT?3的分化培養(yǎng)基中并在微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)聯(lián)合含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT?3的分化培養(yǎng)基能夠非常顯著地提高三維膠原海綿支架上培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的能力以及神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力，其作用效果較單獨(dú)使用微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT?3分化培養(yǎng)基均具有顯著的提升。該方法對(duì)臨床細(xì)胞移植治療具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

神經(jīng)干細(xì)胞作為一種具備自我更新能力及多向分化潛能的細(xì)胞,來源于神經(jīng)組織并可生成神經(jīng)組織，在適當(dāng)條件下可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的功能重建和神經(jīng)再生提供了一條新的途徑，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。近年來隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，尋找能夠培養(yǎng)獲得具有更高分化和遷移能力的種子細(xì)胞的方法對(duì)于細(xì)胞移植治療具有非常重要的意義。

微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)是一種微重力培養(yǎng)系統(tǒng)，利用旋轉(zhuǎn)使培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞或材料在旋轉(zhuǎn)力及重力雙重影響下而保持懸浮狀態(tài)。RCCS系統(tǒng)在藥物、醫(yī)學(xué)研究、再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞療法中都有著廣泛的應(yīng)用前景。神經(jīng)生長(zhǎng)因子-3(NT-3)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子。。膠原海綿支架材料具有良好的孔隙度，有利于細(xì)胞培養(yǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送和代謝產(chǎn)物排出；在未來的細(xì)胞移植治療中，接種在細(xì)胞支架上的細(xì)胞還有利于將移植的細(xì)胞固定在損傷部位，避免移植的細(xì)胞被血液和組織液沖散。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的體外培養(yǎng)方法，該體外培養(yǎng)方法可顯著提高神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化能力和遷移能力。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行了大量的摸索。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，雖然微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可模擬微重力環(huán)境，有利于細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞培養(yǎng)密度，便于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，但是在微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)于其向神經(jīng)元的分化能力和遷移能力的促進(jìn)作用并不理想。本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，在采用微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)基中同時(shí)添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT-3，NT-3和微重力培養(yǎng)環(huán)境可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，極大地提升神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化能力和神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力。

具體地，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的體外培養(yǎng)方法，其包括將神經(jīng)干細(xì)胞置于含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT-3的分化培養(yǎng)基中并在微重力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的步驟。

本發(fā)明在研發(fā)過程中嘗試過其他神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，但發(fā)現(xiàn)其他多種細(xì)胞培養(yǎng)常用的NGF均不能與微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生協(xié)同作用，其對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化能力和遷移能力的促進(jìn)作用十分有限。

具體地，所述含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT-3的分化培養(yǎng)基中，NT-3的濃度為30-80ng/ml。將NT-3的濃度控制在上述范圍內(nèi)，可使得NT-3與微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生更優(yōu)的協(xié)同作用。

優(yōu)選地，所述含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT-3的分化培養(yǎng)基中，NT-3的濃度為40-60ng/ml。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT-3的分化培養(yǎng)基中，NT-3的濃度為50ng/ml。NT-3的濃度為50ng/ml時(shí)，NT-3與微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)環(huán)境的協(xié)同增效作用最強(qiáng)，神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化能力和遷移能力的提升效果最佳。

以上所述的含神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT-3的分化培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分：非必需氨基酸0.1-0.2mM，丙酮酸鈉1-2mM，B272-3％(體積百分比)，谷氨酸2-3mM，葡萄糖30-40mM，NT-3 40-60ng/ml。采用上述分化培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞能夠在微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)環(huán)境下更好地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化能力和遷移能力的提高。