[發明專利]檢測番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其應用

在審

• 申請號: 202010962630.2
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN111961750A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 吳志明;王鵬;李亞棟;康忱;田哲娟;王洪樂;邙光偉;楊超沙;王美娥
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 石家莊海天知識產權代理有限公司 13101
• 代理人: 田文其

本發明涉及分子生物學及作物育種技術領域，特別是指檢測番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty?1基因分型的KASP引物及其應用。番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty?1在第3461堿基的位置存在一處SNP位點，該SNP位點堿基的突變導致Ty?1基因抗性的改變。本發明基于該SNP位點設計了一組可用于基因分型的KASP引物和包含該KASP引物的試劑盒。本發明中的KASP引物和試劑盒可用于鑒定番茄中是否含有番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty?1，區分含有Ty?1的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄和不含有Ty?1感番茄黃化曲葉病毒病的番茄。本發明相比現有技術可對番茄植株在苗期進行快速、準確、高通量的抗病性鑒定，降低苗期人工接種和田間抗病鑒定工作量，其應用可提高番茄育種效率、節約育種成本、加快育種進程。

技術領域

本發明涉及分子生物學及作物育種技術領域，特別是指檢測番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其應用。

背景技術

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄屬的一種一年生或多年生草本植物，起源于南美洲，是一種世界性的蔬菜作物，也是我國的主要栽培蔬菜之一。隨著番茄栽培面積的擴大、栽培方式的多樣化和連作障礙等影響，番茄病蟲害也在不斷加劇。近幾年，由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引起的番茄黃化曲葉病毒病已成為全世界番茄生產上危害最嚴重的病害之一。感病植株初期上部葉片首先表現黃化型花葉，生長緩慢或停滯，節間變短，植株明顯矮化。后期發病嚴重時植株生長停滯、矮化，開花后坐果困難，果實不能正常轉色，損失達到100％。

培育抗TYLCV的新品種是防治此病的根本途徑，隨著番茄育種技術的不斷進步，番茄已經由傳統育種轉向現代分子標記輔助的育種研究，分子標記輔助選擇是對目標性狀在DNA水平上的選擇，不受環境影響，不受等位基因顯隱性關系干擾，選擇結果準確可靠。目前國際植物新品種保護聯盟(UPOV)在BMT分子測試指南中，已將構建DNA分子標記的方法確定為SSR(Simple sequence repeats)和SNP(Single nucleotide polymorphism)標記。SNP標記作為第3代分子標記，目前被公認是極具應用前景的分子標記技術，基于SNP標記開發了許多穩定、高效的SNP分型技術如基因芯片、競爭性等位基因特異PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)標記，已成功替代傳統的SNP電泳分析，其中KASP技術具有高通量、省時、便捷的特點，其特點是基于引物末端堿基的特異匹配對SNP分型，可在廣泛的基因組DNA樣品中對SNP位點進行精準的雙等位基因判斷，具有高度穩定性與準確性，成為SNP基因分型的主流。其主要特征是引物采用3條特異性引物，其中上游引物2條，3’端為等位基因變異堿基，5’端添加通用熒光接頭序列，通用的下游引物為普通引物，常規PCR擴增，終點法熒光信號檢測。

目前，番茄抗黃化曲葉病毒病抗病基因主要有：Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5。幾乎所有的抗病品種選育中Ty-1和Ty-3/Ty3a基因被認為是復等位基因，也是抗番茄黃化曲葉病毒病的最重要的基因，其抗病具有持久和穩定性，廣泛應用于番茄抗黃化曲葉病毒育種中。因此利用KASP技術快速準確地鑒定番茄黃化曲葉病毒病的抗病基因Ty-1等可以大幅度提高新品種的選育效率，縮短育種年限。

KASP技術(競爭性等位基因特異性PCR)是目前國際上主流的基因分型方法之一，基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP和特定位點上的InDel進行精準的雙等位基因判斷。引物采用3條特異性引物，其中上游引物2條，3’端為等位基因變異堿基，5’端添加通用熒光接頭序列，下游引物為普通引物，常規PCR擴增，終點法熒光信號檢測。

KASP的特異性引物通常采用24bp-26bp，會有更高的特異性，對比常規酶切電泳準確率高；只需常規PCR擴增，所需時間短；無需昂貴的雙色標記探針，靈活性超強；最低的DNA樣本需求，無需全基因組擴增；快速高效，可以高通量檢測大量樣本的少數幾個標記。

其主要操作步驟如下：