[發明專利]IL-6R抑制劑及IL-4R抑制劑聯合用藥在乳腺癌化療藥物的中的應用

在審

• 申請號: 202010962513.6
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112023055A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 周佳敏;王國華;葉莉莎;高純一;吳昊;鮑海妮;耿勁松
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: A61K45/06
• 分類號: A61K45/06;A61K33/243;A61P15/14;A61P35/00;A61P29/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 錢超

1.IL-6R抑制劑及IL-4R抑制劑聯合用藥在乳腺癌化療藥物的中的應用，其特征在于：所述乳腺癌化療藥物為順鉑。

2.根據權利要求1所述的多肽類似物在治療乳腺癌藥物的中的應用，其特征在于：IL-6R抑制劑為細胞介素-6（IL-6）受體抑制劑，IL-4R抑制劑為白介素-4（IL-4）受體抑制劑，IL-4參與促進巨噬細胞M2極化，IL-6是一種功能廣泛的多效性細胞因子，兩者都參與調節多種細胞的生長與分化，具有調節免疫應答、急性期反應及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應中起重要作用；在腫瘤微環境中，IL-4和IL-6參與促進巨噬細胞極化，在腫瘤發展晚期兩者協同作用，促進巨噬細胞M2極化，具有抗炎作用。

3.根據權利要求1所述多肽類似物在治療乳腺癌藥物的中的應用，其特征在于，具體步驟為：

第一步，建立體外乳腺癌細胞和巨噬細胞共培養體系模擬人體內環境：其中乳腺癌細胞選用的是MDA-MB-468細胞，巨噬細胞選用的是人單核細胞THP-1；

第二步，研究IL-6R抑制劑與IL-4R抑制劑聯合使用在乳腺癌化療藥物中效果：IL-4 /IL-6協同誘導靶基因的體外驗證；

第三步：單獨或聯合使用IL-4和IL-6處理24小時的巨噬細胞中指示基因的mRNA表達分析；

第四步：IL-6和IL-4的雙重刺激增強了IL-4靶向的趨化因子如CCL17、CCL18、CCL23和CCL8的表達；

第五步：使用Trizol法抽提巨噬細胞中總RNA，每個樣品中加入1mlTrizol，轉移入離心管；

第六步：按每毫升Trizol加入200微升的氯仿，蓋緊離心管，用手振蕩混勻15s，室溫放置十分鐘；

第七步：然后，在四攝氏度12000g離心十五分鐘，吸取上層水相，移至另一新的離心管中，按每毫升Trizol加入0.6ml異戊醇，混勻放置室溫5-10分鐘；

第八步，然后，在四攝氏度12000g離心十分鐘，棄上清液，按每毫升Trizol加入1ml的75%乙醇，溫和振蕩，懸浮沉淀；

第九步：然后，在室溫晾干或真空干燥5-10min，再測260nm下吸光值定量RNA濃度；

第十步：利用cDNA試劑盒反轉錄；

第十一步：使用Bio-Rad的CFX96系統和iQ SYBR green Supermix（Bio-Rad）進行實時定量PCR，內參為β-actin；

第十二步：在后續的實驗用分別用IL-6R和IL-4R抑制劑處理巨噬細胞，中IL-6R抑制劑為托珠單抗，使用濃度為200μg/ mL；IL-4R抑制劑為dupilumab，使用濃度為1500μg/ mL；

第十三步，在巨噬細胞Thp-1與乳腺癌細胞MDA-MB-468共培養的過程中，Thp-1細胞在上層，MDA-MB-468在下層，在上層加入兩種抑制劑達到先處理Thp-1的目的與乳腺癌細胞即MDA-MB-468細胞共培養：其中巨噬細胞在上層，MDA-MB-468細胞在下層，中間用0.4μm的PET膜分隔開，保證細胞因子可以通過，而細胞不能通過，之后用流氏檢測腫瘤細胞的凋亡情況；

第十四步，細胞收集： Thp-1懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細胞數為5×10⁶/mL，1000r/min離心5min，棄去培養液；

第十五步：用孵育緩沖液即PBS緩沖液洗滌1次，1000r/min離心5min；

第十六步：用100ul的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15min，所述標記溶液為SA-FLOUS標記溶液；

第十七步：1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液即PBS緩沖液洗1次；

第十八步：加入熒光SA-FLOUS溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動；

第十九步：流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI；

第二十步：結果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能；細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生；因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號；正常活細胞與此相似；

第二十一步，研究IL-6和IL-4R抑制劑聯合使用的作用，設計實驗驗證IL-6R抑制劑聯合IL-4R抑制劑是否降低了乳腺癌細胞系的致瘤性：在裸鼠背部皮下注射分別用IL-6R抑制劑或IL-4R抑制劑培養過的MDA-MB-231細胞，10-14天后，用于實驗的12只裸鼠在接種部位的發生均生長出可觸及的皮下腫瘤，之后開始用藥處理，藥物選用的順鉑，在開始用藥前，針對野生型，即未處理的MDA-MB-468細胞裸鼠皮下瘤模型，確定了順鉑的用藥濃度及用藥時長，最后選用的順鉑的用藥處理方式為：每千克kg的裸鼠給藥4mg，生理鹽水溶解順鉑粉末，腹腔注射，每5日給一次藥；在聯合使用組，腫瘤體積結果顯示，對于腫瘤的抑制作用聯合處理組腫瘤體積顯著低于其他組（p0.01），提示聯合用藥對于乳腺癌治療作用意義；以上各組用藥對體重沒有明顯影響，表明處理未對小鼠產生毒性。