[發明專利]一種動物原代干細胞除菌培養液的制備方法

有效

• 申請號: 202010959879.8
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112080461B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 王鳳武;李軍燕;李曉奇;羅曉平;張瓊琳;孫杰;閆紅霞;侯勇躍
• 申請（專利權）人: 內蒙古自治區農牧業科學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0735
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明屬于分離培養原代干細胞技術領域，公開了一種動物原代干細胞除菌培養液的制備方法，無菌條件下，取孕中期綿羊胎兒，剪切相應組織于培養液II中靜置；采用組織機械分離方法分離，用培養液I于37℃5％CO₂飽和濕度條件下培養綿羊胎兒組織原代細胞48h～96h；細胞克隆出現后用D?PBS洗3遍，挑取狀態較好的細胞克隆用培養液III培養，培養至3～4代凍存備用。本發明所配置的培養液能100％確保在96h內分離培養動物原代干細胞時無細菌性污染發生。同時本發明所采用的培養液能夠保證分離的動物原代細胞保持干細胞特性。本發明能夠確保在從動物組織中分離培養原代的干細胞的過程不發生細菌或真菌性污染。

技術領域

本發明屬于分離培養原代干細胞技術領域，尤其涉及一種動物原代干細胞除菌培養液的制備方法。

背景技術

目前，動物是干細胞的重要來源和研究素材。從動物機體組織中分離培養原代干細胞首先面臨的就是來自于組織和操作過程中所帶來的細菌或真菌污染常常導致原代干細胞分離培養失敗，帶來的損失有時無法估量，尤其是珍稀野生動物或高價值動物原代干細胞，損失更大。通常，大家在初次從組織中分離原代干細胞時在PBS和培養基中加入1％的雙抗來達到除菌的目的。但在實際中，這樣做遠遠不夠，經常導致培養的干細胞發生污染而導致原代干細胞分離培養失敗。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：現有技術中從動物機體組織中分離培養原代干細胞，經常導致培養的干細胞發生污染而導致原代干細胞分離培養失敗。

解決以上問題及缺陷的難度為：在保證所分離培養的動物干細胞不發生分化的前提下不發生污染。

解決以上問題及缺陷的意義為：能夠確保所分離培養的干細胞不發生分化情況下并確保不發生細菌性污染。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種動物原代干細胞除菌培養液的制備方法。

本發明是這樣實現的，一種動物原代干細胞除菌培養液的制備方法，所述動物原代干細胞除菌培養液的制備方法，包括：

步驟一，無菌條件下，取孕中期綿羊胎兒，剪切相應組織于培養液II中靜置30min；

步驟二，采用組織機械分離方法分離，用培養液I于37℃5％CO₂飽和濕度條件下培養綿羊胎兒組織原代細胞48h～96h；

步驟三，細胞克隆出現后用D-PBS洗3遍，挑取狀態較好的細胞克隆用培養液III培養，培養至3～4代凍存備用。

進一步，所述培養基液I：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸鈉、微量β-巰基乙醇、5ng或500u/mL LIF、5ng/mL bFGF、15％FBS、青霉素200U、鏈霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg、兩性霉素B5μg，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的濾器過濾，4℃保存。

進一步，所述培養液II：青霉素200U、鏈霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素、15μg兩性霉素B5μg，D-PBS定容至100mL，4℃保存。

進一步，所述培養液III：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸鈉、微量β-巰基乙醇、5ng或500u/mL LIF、5ng/mL bFGF+15％FBS，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的濾器過濾，4℃保存。

本發明滿足動物干細胞的生長營養需求，保證動物干細胞培養過程中不發生細菌性污染。

結合上述的所有技術方案，本發明所具備的優點及積極效果為：本發明所配置的培養液能100％確保在96h內分離培養動物原代干細胞時無細菌性污染發生。同時本發明所采用的培養液能夠保證分離的動物原代細胞保持干細胞特性。

附圖說明