[發明專利]一種動物原代干細胞除菌培養液的制備方法

有效

• 申請號: 202010959879.8
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN112080461B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 王鳳武;李軍燕;李曉奇;羅曉平;張瓊琳;孫杰;閆紅霞;侯勇躍
• 申請（專利權）人: 內蒙古自治區農牧業科學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0735
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種綿羊胎兒組織中干細胞的原代培養方法，其特征在于，所述綿羊胎兒組織中干細胞的原代培養方法，包括：

無菌條件下，取孕中期綿羊胎兒，剪切相應組織于培養液II中靜置30min；

采用組織機械分離方法分離，用培養液I于37 ℃ 5% CO₂ 飽和濕度條件下培養綿羊胎兒組織原代細胞48h～96h；

細胞克隆出現后用D-PBS洗，挑取狀態較好的細胞克隆用培養液III培養，培養凍存備用；

所述培養液I： 1% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉、微量β-巰基乙醇、500u/mL LIF、5 ng /mL bFGF、15% FBS、青霉素200U、鏈霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素 15μg、兩性霉素B5μg ，DMEM低糖定容至100 mL，用0.22 μL 的濾器過濾，4 ℃保存；

所述培養液II：青霉素200U、鏈霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素 15μg、兩性霉素B5μg，D-PBS定容至100 mL，4 ℃保存；

所述培養液III：1% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉、微量β-巰基乙醇、500u/mL LIF、5 ng /mL bFGF+15% FBS，DMEM低糖定容至100 mL，用0.22μL的濾器過濾，4℃保存。

2.如權利要求1所述綿羊胎兒組織中干細胞的原代培養方法，其特征在于，細胞克隆出現后用D-PBS洗3遍，挑取狀態較好的細胞克隆用培養液III培養，培養至3～4代凍存備用。