[發明專利]一種基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010958566.0
• 申請日: 2020-09-11
• 公開（公告）號: CN112195521A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 曹振;羅秉輪;宋東亮;秦雪梅;戴廣偉
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6858;C12Q1/70;C12Q1/04
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務所(普通合伙) 31288
• 代理人: 劉潔瑜

1.一種基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)從樣本中共提取DNA和RNA；

2)以RNA為模板，通過逆轉錄生成cDNA第一鏈，最終形成RNA/cDNA雜交雙鏈和原始DNA的混合液；

3)使用包含轉座子序列的轉座酶復合體對步驟2)中的RNA/cDNA雜交雙鏈和原始DNA進行片段化，并同時加上接頭序列；

4)使用逆轉錄酶和具有鏈置換活性的DNA聚合酶對步驟3)中的產物進行缺口補齊；

5)用文庫擴增引物對步驟4)中的產物進行擴增；

6)步驟5)所得產物經純化回收后，得到混合RNA/DNA文庫；

7)對步驟6)所得的混合RNA/DNA文庫進行質檢。

2.如權利要求1所述的基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法，其特征在于，步驟7)中的所述質檢包括鑒定DNA和RNA核酸物質是否都被建成文庫。

3.如權利要求2所述的基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法，其特征在于，所述鑒定DNA和RNA核酸物質是否都被建成文庫的方法包括通過qPCR技術來檢測文庫中管家基因GAPDH的含量，qPCR引物設計區域位于人基因組GAPDH基因的跨內含子與外顯子區域，熒光探針分別為FAM和TAMRA，結果判斷依據是只有DNA文庫才有內含子區域的TAMRA熒光信號，而DNA文庫和RNA文庫都會貢獻外顯子區域的FAM信號值。

4.一種基于轉座酶的DNA/RNA共建庫試劑盒，其特征在于，包括：逆轉錄試劑、包含轉座子序列的轉座酶復合體片段化試劑、缺口補齊試劑、文庫擴增試劑、文庫質檢試劑。

5.如權利要求4所述的基于轉座酶的DNA/RNA共建庫試劑盒，其特征在于，所述文庫質檢試劑包括包括鑒定DNA和RNA核酸物質是否都被建成文庫的試劑，包括通過熒光定量PCR來檢測文庫中管家基因GAPDH的含量的相關試劑，其中qPCR引物設計區域位于人基因組GAPDH基因的跨內含子與外顯子區域，熒光探針分別為FAM和TAMRA，結果判斷依據是只有DNA文庫才有內含子區域的TAMRA熒光信號，而DNA文庫和RNA文庫都會貢獻外顯子區域的FAM信號值。

6.一種鑒定樣本中所含微生物種類的方法，其特征在于，包括步驟：

1)從樣本中共提取DNA和RNA；

2)以RNA為模板，通過逆轉錄生成cDNA第一鏈，最終形成RNA/cDNA雜交雙鏈和原始DNA的混合液；

3)使用包含轉座子序列的轉座酶復合體對步驟2)中的RNA/cDNA雜交雙鏈和原始DNA進行片段化，并同時加上接頭序列；

4)使用逆轉錄酶和具有鏈置換活性的DNA聚合酶對步驟3)中的產物進行缺口補齊；

5)用文庫擴增引物對步驟4)中的產物進行擴增；

6)步驟5)所得產物經純化回收后，得到混合RNA/DNA文庫；

7)對步驟6)所得的混合RNA/DNA文庫進行質檢；

8)對質檢后的混合RNA/DNA文庫進行高通量測序。

7.一種鑒定樣本中所含微生物種類的試劑盒，其特征在于包括：逆轉錄試劑、包含轉座子序列的轉座酶復合體片段化試劑、缺口補齊試劑、文庫擴增試劑、文庫質檢試劑。

8.如權利要求7所述的鑒定樣本中所含微生物種類的試劑盒，其特征在于，所述文庫質檢試劑包括鑒定DNA和RNA核酸物質是否都被建成文庫的試劑。