[發明專利]一種基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010958566.0
• 申請日: 2020-09-11
• 公開（公告）號: CN112195521A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 曹振;羅秉輪;宋東亮;秦雪梅;戴廣偉
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6858;C12Q1/70;C12Q1/04
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務所(普通合伙) 31288
• 代理人: 劉潔瑜

本發明公開了一種基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法及其試劑盒，該方法包括步驟：1)從樣本中共提取DNA和RNA；2)以RNA為模板，通過逆轉錄生成cDNA第一鏈，最終形成RNA/cDNA雜交雙鏈和原始DNA的混合液；3)使用包含轉座子序列的轉座酶復合體對步驟2)中的RNA/cDNA雜交雙鏈和原始DNA進行片段化，并同時加上接頭序列；4)使用逆轉錄酶和具有鏈置換活性的DNA聚合酶對產物進行缺口補齊；5)用文庫擴增引物對產物進行擴增；6)產物經純化回收后，得到混合的RNA/DNA文庫；7)對步驟6)所得的混合RNA/DNA文庫進行質檢。該方法具有建庫時間短、操作簡單、成本低的優點。本發明還公開了上述方法和試劑盒在鑒定微生物種類以及在檢測癌癥組織樣本的基因突變和基因融合方面的應用。

技術領域

本發明涉及DNA/RNA文庫構建，尤其涉及一種基于轉座酶的DNA/RNA共建庫方法及其試劑盒在微生物鑒定中的應用。

背景技術

高通量測序(NGS)在腫瘤檢測方面的應用：

以人基因組為代表的哺乳動物基因組由內含子與外顯子區域構成，其中外顯子區域只占整個基因組序列的很小一部分。基因轉錄后產生RNA前體，后者通過可變剪切去除內含子序列，剩下的外顯子區域拼接為mRNA序列，最終翻譯為蛋白質。

腫瘤基因組的變異主要包括單點突變(SNV)、插入/缺失(InDel)、拷貝數變異(CNV)、基因融合、基因表達差異等。基因的點突變在腫瘤細胞中最為常見，針對性的腫瘤靶向用藥也比較成熟。比如EGFR基因的T790M突變導致的非小細胞肺癌病患，使用奧希替尼治療的平均存活期可到40個月。另一大類的變異是基因融合，主要指的是基因組上兩個或兩個以上不同區域的編碼基因首尾相連，置于一套調控序列控制下。基因融合是一類常見的腫瘤發生機制，是多種腫瘤靶向藥的生物標標志物(biomarker)，如治療ALK融合的克唑替尼。

單個或少量的堿基突變可以用ARMS-PCR、一代測序或者數字PCR等技術來檢測，但是腫瘤發生發展過程中往往涉及多個基因的多位點變異，上述傳統方法難以進行如此廣泛的基因檢測。而高通量測序技術的出現，很順理成章的解決了這個難題，該技術直接對整個基因組或者轉錄組進行測序，能夠全面地“掃描”腫瘤相關的基因變異情況，更能在基因組學的維度發現未知的腫瘤靶標。

對腫瘤細胞的基因組進行高通量測序(NGS)，可輕松實現單堿基變異的監控，但若想監控基因融合變異就比較捉襟見肘了，原因正是上文中提及的整個基因組上分布有大占比的內含子區域和小占比的外顯子區域。基因融合針對的是外顯子區域，如果通過基因組測序來監控融合，必須進行跨內含子規模的測序。目前主流的高通量測序是短讀長的模式，長度只有300～600bp，無法涵蓋完整的內含子區。因此對基因融合的監測，需對腫瘤細胞的轉錄組進行高通量測序。目前癌癥檢測還是以實體瘤組織細胞的基因組DNA測序為主，輔以轉錄組RNA測序來檢測融合，但兩者的重要程度日趨一致。考慮到腫瘤的臨床樣本多以福爾馬林固定石蠟包埋處理的樣本(Formalin-Fixed and Parrffin Embedded，FFPE)為主，這類樣本的量比較少，難以分開進行DNA建庫和RNA建庫實驗。近年來有人提出一個方案用于FFPE的DNA/RNA共建庫(CN106222164A)，該方案仍然使用的是傳統的RNA建庫流程，流程繁瑣、耗時長、產量低，難以解決腫瘤細胞的DNA和RNA共建庫的臨床難題。

高通量測序在感染檢測方面的應用：