[發明專利]一種豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素及制備工藝和應用

有效

• 申請號: 202010957914.2
• 申請日: 2020-09-14
• 公開（公告）號: CN111825774B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 張淵魁;唐青海
• 申請（專利權）人: 兆豐華生物科技（南京）有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C07K16/02;C07K16/12;A61K39/295;A61K39/187;A61K39/108;A61P31/04;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 李嘉寧

1.一種豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素，其特征在于：所述豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素基因核酸序列如SEQ ID No：1所示；所述豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；包括5個核心抗原表位，分別為：

表位1：NIQKLIALLFIVLN，

表位2：YLCNQMRKIAMAAVL，

表位3：VWGLALASEFDPRVPSS，

表位4：ALIYPLYAHGAPQT，

表位5：CVWNNKTPNSLPPFSVED。

2.權利要求1所述豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素的制備方法，其特征在于：

（1）將雙價LTB毒素開放閱讀框ORF與pGEX4T-1載體連接，構建重組表達載體pGEX-LTB，轉化BL21(DE3)感受態，篩選獲得重組表達菌株BL21(DE3)-pGEX-LTB；

（2）重組表達菌BL21(DE3)-pGEX-LTB，LB培養，在37℃，終濃度為0.5mM的IPTG誘導4h；

（3）12000 r/min，4℃離心5min，收集菌體；

（4）每1L菌液的菌體加入PBS液40mL，充分懸起菌體；

（5）將加入PBS液的菌液超聲波破碎，條件為：能量值60%，每間隔3s超聲3s，總時長為0.5h；

（6）12000 r/min，4℃，離心15min，收集沉淀蛋白；

（7）往沉淀蛋白中加入PBS緩沖液30mL；

（8 ）超聲裂解：能量值60%，每間隔5s超聲5s，總時長為1h；

（9 ）12000 r/min，4℃，離心15min，收集沉淀蛋白；

（10 ）往沉淀蛋白中加入PBS緩沖液10mL，漩渦振蕩制備得到純化的LTB重組蛋白懸液。

3.一種雙價LTB抗體的制備工藝，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將權利要求2制得的LTB重組蛋白懸液與疫苗佐劑以1:1的體積比例混合，混合順序為：將蛋白溶液緩慢加入到佐劑溶液中，至蛋白終濃度為0.1mg/mL，同時以14000r/min的轉速攪拌乳化0.5h；

（2）蛋雞的免疫：對蛋雞進行胸部肌肉注射，劑量為1mL/只；依次于初次免疫后第28天和60天，進行第2次和第3次加強免疫；抽取第3次免疫后7天至30天的雞蛋采用westernblot方法檢測LTB特異性卵黃抗體效價，當抗體效價達到32000倍以上時，采用PEG6000從雞蛋中提取收集卵黃抗體。

4.根據權利要求3所述的雙價LTB抗體的制備工藝，其特征在于：所述疫苗佐劑為ISA201、ISA71VG、PET01氫氧化鋁、礦物油中的一種或幾種。

5.權利要求1所述豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素的應用，其特征在于：與豬瘟脾淋苗制成二聯疫苗。

6.根據權利要求5所述豬致病性大腸桿菌雙價LTB毒素的應用，其特征在于：將雙價LTB毒素2～10μg與脾淋苗1頭份150RID混合均勻，凍干。