[發(fā)明專利]一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其在膿毒癥中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010953304.5
• 申請(qǐng)日: 2020-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN112029769B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬曉媛;王芳杰;唐婉琦;李衛(wèi);楊雪;梁華平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/89;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭麗

1.一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）確定小鼠待敲除基因的靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)Cyp1a1基因的sgRNA，所述sgRNA包括Cyp1a1-Sg1、Cyp1a1-Sg2、Cyp1a1-Sg3和Cyp1a1-Sg4，其序列分別如SEQ ID No: 2、SEQ IDNo: 3、SEQ ID No: 4和SEQ ID No: 5所示；

（2）將有活性的sgRNA與Cas9 mRNA或Cas9 Protein共注射或共電轉(zhuǎn)至小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，并將受精卵移植入受體母鼠孕育，獲得F0代Cyp1a1基因敲除小鼠；

（3）將F0代Cyp1a1基因敲除小鼠與正常野生型小鼠雜交，獲得F1代Cyp1a1基因敲除小鼠模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（1）還包括：將設(shè)計(jì)的sgRNA進(jìn)行體外擴(kuò)增構(gòu)建表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒，并對(duì)sgRNA體外活性測(cè)試。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（2）還包括：提取F0代小鼠的基因組DNA進(jìn)行基因型鑒定，獲得F0代Cyp1a1基因成功敲除的小鼠。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（2）中小鼠和母鼠的品系為C57BL/6J。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（3）還包括：對(duì)F1代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，獲得F1代Cyp1a1基因成功敲除的小鼠模型。

6.一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型在膿毒癥中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：（1）通過權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建Cyp1a1基因敲除小鼠，（2）再將Cyp1a1基因敲除小鼠進(jìn)行膿毒癥建模。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：所述膿毒癥建模方法包括：當(dāng)研究Cyp1a1基因敲除小鼠應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素血癥的生存狀況時(shí)，對(duì)Cyp1a1基因敲除小鼠腹腔注射15~20 mg/kg脂多糖；當(dāng)研究Cyp1a1基因敲除小鼠應(yīng)對(duì)革蘭氏陰性菌的生存狀況時(shí)，對(duì)Cyp1a1基因敲除小鼠采用腹腔注射5×10⁷~1×10⁸ CFU大腸桿菌；當(dāng)研究Cyp1a1基因敲除小鼠感染后巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞變化時(shí)，對(duì)Cyp1a1基因敲除小鼠采用腹腔注射3~7×10⁷ CFU大腸桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，還將Cyp1a1基因敲除小鼠運(yùn)用在膿毒癥“精氨酸-胍丁胺-多胺/γ氨基丁酸”代謝研究中，包括如下步驟：

A1，通過權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建Cyp1a1基因敲除小鼠；

A2，對(duì)Cyp1a1基因敲除小鼠腹腔注射5~10 mg/kg脂多糖；

A3，檢測(cè)小鼠體內(nèi)精氨酸酶、胍丁胺酶、二胺氧化酶和精氨酸脫羧酶的活性。