[發(fā)明專利]一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其在膿毒癥中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010953304.5
• 申請(qǐng)日: 2020-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112029769B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬曉媛;王芳杰;唐婉琦;李衛(wèi);楊雪;梁華平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/89;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭麗

本發(fā)明公開(kāi)一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其在膿毒癥中的應(yīng)用，構(gòu)建方法包括：確定小鼠待敲除基因的靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)sgRNA，其序列如SEQ ID No:2?5所示；將有活性的sgRNA與Cas9 mRNA或Cas9 Protein共注射或共電轉(zhuǎn)至小鼠受精卵細(xì)胞中，并將受精卵移植入受體母鼠孕育，獲得F0代基因敲除小鼠；將F0代小鼠與野生型小鼠雜交，獲得F1代Cyp1a1基因敲除小鼠。本發(fā)明成功制備了Cyp1a1基因敲除小鼠模型，并首次將其應(yīng)用于膿毒癥病理進(jìn)程研究中，意外地發(fā)現(xiàn)Cyp1a1基因敲除小鼠的細(xì)菌清除能力顯著增強(qiáng)，在應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素血癥與革蘭氏陰性菌攻擊時(shí)的生存能力提高，抗感染能力增強(qiáng)。本發(fā)明還首次將Cyp1a1基因敲除小鼠運(yùn)用在膿毒癥的代謝調(diào)控研究中，為危重癥領(lǐng)域相關(guān)代謝機(jī)制研究提供可靠的動(dòng)物模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，以及Cyp1a1基因敲除小鼠在膿毒癥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

膿毒癥3.0將人類膿毒癥定義為機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)所致危及生命的器官功能障礙。隨著人們對(duì)膿毒癥發(fā)病本質(zhì)的逐步了解，已認(rèn)識(shí)到膿毒癥的發(fā)病與感染、炎癥、凝血、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫反應(yīng)等密切相關(guān)，并涉及全身多器官、多系統(tǒng)的異常改變。

代謝途徑的紊亂、宿主的缺氧反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的過(guò)度驅(qū)動(dòng)是膿毒癥在分子水平上的病理標(biāo)志。雖然膿毒癥發(fā)病機(jī)理中的炎癥反應(yīng)機(jī)制已被很好地理解，但那些導(dǎo)致代謝失調(diào)和多器官功能障礙或衰竭的機(jī)制仍不清楚。在創(chuàng)傷和膿毒癥中觀察到代謝過(guò)程的變化與免疫失調(diào)有很強(qiáng)的相關(guān)性，這種免疫代謝紊亂嚴(yán)重影響患者預(yù)后。尤其對(duì)于嚴(yán)重創(chuàng)/燒傷、休克、外科手術(shù)打擊引發(fā)機(jī)體代謝功能障礙的確切機(jī)制及其在膿毒癥中的地位認(rèn)識(shí)不足，同時(shí)臨床上缺乏切實(shí)可行的代謝狀態(tài)評(píng)估方法與代謝治療手段。

細(xì)胞色素P4501A1(CYP1A1)為一種羥化酶，可催化代謝多環(huán)芳烴類(PAHS)、芳香胺類、苯類等形成極性復(fù)合物。在特殊環(huán)境下，外源性物質(zhì)作為配體與體內(nèi)芳香烴受體(AHR)結(jié)合后，導(dǎo)致CYP1A1高表達(dá)，高活性物質(zhì)與DNA共價(jià)結(jié)合，從而誘導(dǎo)突變，具有致癌作用。作為體內(nèi)重要的代謝酶，CYP1A1還參與機(jī)體多種生理過(guò)程，如免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激等；與多種疾病相關(guān)，如各種腫瘤、急慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化等。然而，CYP1A1在膿毒癥代謝障礙中扮演何種角色，發(fā)揮何種功能尚不明確，并且目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)CYP1A1參與調(diào)控膿毒癥病理進(jìn)程中“精氨酸-胍丁胺-多胺/γ氨基丁酸”代謝軸的研究報(bào)道。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決或至少部分解決上述存在的技術(shù)問(wèn)題，提供一種Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，并將成功構(gòu)建的Cyp1a1基因敲除小鼠應(yīng)用在膿毒癥代謝調(diào)控的研究中，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。

具體地，本發(fā)明提供的Cyp1a1基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)確定小鼠待敲除基因的靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)Cyp1a1基因的sgRNA，所述sgRNA包括Cyp1a1-Sg1、Cyp1a1-Sg2、Cyp1a1-Sg3和Cyp1a1-Sg4，其序列分別如SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ IDNo:4和SEQ ID No:5所示；(2)將有活性的sgRNA與Cas9 mRNA或Cas9 Protein共注射或共電轉(zhuǎn)至小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，并將受精卵移植入受體母鼠孕育，獲得F0代Cyp1a1基因敲除小鼠；(3)將F0代Cyp1a1基因敲除小鼠與正常野生型小鼠雜交，獲得F1代Cyp1a1基因敲除小鼠模型。

本發(fā)明成功制備了Cyp1a1基因敲除小鼠模型，并且本發(fā)明設(shè)計(jì)的4條sgRNA具有敲除效率高、無(wú)外源基因干擾的優(yōu)點(diǎn)，能保證得到穩(wěn)定表達(dá)基因型的Cyp1a1全身敲除小鼠模型。

進(jìn)一步，所述步驟(1)還包括：將設(shè)計(jì)的sgRNA進(jìn)行體外擴(kuò)增構(gòu)建表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒，并對(duì)sgRNA體外活性測(cè)試。