[發(fā)明專利]一種對酸敏感轉座子插入突變體的反向篩選方法

有效

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• 申請日: 2020-09-11
• 公開（公告）號: CN112080546B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設計）人: 季學猛;王碩
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12N15/10;C12R1/01
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 邢月;張艷梅

本發(fā)明提供了一種對酸敏感轉座子插入突變體的反向篩選方法，包括如下步驟：(1)轉座子插入突變體庫的構建；(2)殺菌型抗生素和酸聯(lián)合處理；(3)細菌培養(yǎng)與單克隆挑取；(4)細菌耐酸表型驗證。本發(fā)明所述的對酸敏感轉座子插入突變體的反向篩選方法依賴于酸性環(huán)境對殺菌型抗生素的拮抗作用，這些抗生素能特異性地殺死復制活躍細菌，而對環(huán)境脅迫下生長受抑制的細菌的殺菌效果較弱。測試結果表明，獲得的突變體對酸敏感率高達100％，方法簡單有效，在革蘭氏陰性代表菌阪崎腸桿菌和革蘭氏陽性代表菌單核增生李斯特菌都得到了成功應用，為基因功能的研究提供新工具和新方法。

技術領域

本發(fā)明屬于基因篩選領域，尤其是涉及一種對酸敏感轉座子插入突變體的反向篩選方法。

背景技術

轉座子(transponson,簡稱Tn),又稱易位子，是指存在于染色體DNA上可以自主復制和位移的一段DNA序列。轉座子可以在不同復制子之間轉移，以非正常重組方式從一個位點插入到另外一個位點，對新位點基因的結構與表達產生多種遺傳效應。現(xiàn)在的研究說明，在生物界中轉座子是普遍存在的，并認為在生物的遺傳進化方面有重要作用。轉座子從一個位置轉座到另一個位置的轉入和切出過程，改變了原有基因的結構和排序，從而產生了突變。

轉座子具有導致DNA隨機誘變的作用，現(xiàn)已成為研究基因功能的重要手段之一，廣泛的應用于構建突變體庫和基因的標定。轉座子具有可選擇的抗性標記而容易在體內鑒定突變，經轉座子誘變的突變子含有已知的DNA片段，可以通過轉座子序列的雜交來鑒定突變基因的位置。經轉座子誘變的突變體具有高度的極性，使得被誘變的基因以及同一操縱子內的下游基因完全喪失功能。

轉座子突變可以迅速獲得大量隨機插入突變體，用于鑒定環(huán)境耐受基因、毒性基因、限速酶基因等研究目的。對于導致環(huán)境耐受的插入突變篩選往往很簡單，可以在抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境耐受菌株具有生長優(yōu)勢而被篩選出來。但是，有時野生型細菌本身對環(huán)境耐受，我們需要篩選環(huán)境耐受決定基因，就需要篩選對環(huán)境敏感的插入突變體并鑒定插入位置，這時，就需要進行大量克隆的篩選。

轉座子突變已經廣泛應用于致病菌的環(huán)境耐受與致病機制研究。食源性致病菌需要穿越胃部的酸性環(huán)境、進入腸道進而引起疾病。一般對酸敏感的細菌被認為不能夠導致食源性疾病，因此，酸性環(huán)境耐受與食源性致病菌的致病能力密切相關，也正因為此，食源性致病菌的酸性環(huán)境耐受機制受到廣泛關注與研究。酸性環(huán)境耐受機制需要獲得突變體并且表型驗證。轉座子突變雖然可以迅速獲得大量隨機突變體，但導致酸性敏感的突變體一般不足萬分之一，需要進行大量克隆篩選和表型驗證。目前，沒有已經報道的快速便捷的反向篩選酸性敏感菌株的有效方法。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術中的缺陷，提出一種對酸敏感轉座子插入突變體的反向篩選方法。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：

一種對酸敏感轉座子插入突變體的反向篩選方法，包括如下步驟：

(1)轉座子插入突變體庫的構建；

(2)殺菌型抗生素和酸聯(lián)合處理；

(3)細菌培養(yǎng)與單克隆挑取；

(4)細菌耐酸表型驗證。

進一步，所述的步驟(2)中的殺菌型抗生素為干擾細胞壁合成的抗生素或影響細菌蛋白質合成的抗生素中的一種；所述的殺菌型抗生素的濃度為50-1000mg/L。

進一步，所述的干擾細胞壁合成的抗生素為β-內酰胺類抗生素、萬古霉素、替考拉寧或磷霉素中的一種；所述的β-內酰胺類抗生素為青霉素類抗生素或頭孢菌素中的一種。

進一步，所述的影響細菌蛋白質合成的抗生素為氨基糖苷類抗生素。