[發(fā)明專利]一種小麥全蝕病菌特異性分子檢測引物及其檢測方法和應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2020-09-11
• 公開（公告）號: CN112501332B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙偉;戚仁德;遲元凱;徐阿妹;汪濤;曹舜;姜戚
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/686;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 高寧馨

本發(fā)明旨在尋找小麥全蝕病菌中新的分子檢測靶標(biāo)基因，并利用該基因設(shè)計出全蝕病菌的特異性的檢測引物，開發(fā)出全蝕病菌實時定量PCR的檢測方法。開發(fā)出了全蝕病菌實時定量PCR的檢測技術(shù)，研究并開發(fā)出全蝕病菌在合適條件下侵染最低量閾值，開展土壤中殘留病原菌的定性及定量檢測，為病害的預(yù)警提供依據(jù)，為病害的早期防控提供技術(shù)支持，為小麥的豐產(chǎn)提供保障。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種小麥全蝕病菌特異性分子檢測引物及其檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

小麥全蝕病是由禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomyces graminis var.tritici)侵染小麥引起的一種毀滅性真菌病害，該病害于1852年在意大利首次發(fā)現(xiàn)，目前在世界上主要小麥生產(chǎn)地區(qū)均普遍發(fā)生，成為小麥生產(chǎn)上嚴(yán)重威脅的病害之一。該病害于1931年在我國首次報道，并在各個主要小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。近年來，該病害發(fā)病幾率顯著增加，危害程度也有所增加，一般病田引起減產(chǎn)10％-20％，部分危害較重地區(qū)能夠引起小麥的大面積枯死，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量及糧食安全問題。

小麥全蝕病菌在苗期和成株期均可侵染，在黃淮海等地區(qū)的冬小麥種植地區(qū)，病原菌在冬前氣溫較高、濕度較大時即可侵染，小麥進(jìn)入越冬期后，病原菌潛伏在植株體內(nèi)，拔節(jié)抽穗期在植株體內(nèi)快速擴展。同樣，在春天氣溫回升，小麥返青拔節(jié)期可引起侵染，這是病害發(fā)生的一個主要時間點。小麥全蝕病的最開始從小麥須根處侵入，隨后在根上形成黑色的病斑，堵塞根部的水分和營養(yǎng)運輸，導(dǎo)致根部腐爛，發(fā)病部位變黑，俗稱“黑腳病”，植株表現(xiàn)為矮縮癥狀，進(jìn)而影響到植株生長，整株出現(xiàn)枯白穗癥狀。

小麥全蝕病菌主要以菌絲體伴隨病殘體在土壤中長期留存，近年來，伴隨秸稈還田等耕作模式的改變，田間病原菌殘留量積累量加大，導(dǎo)致小麥全蝕病的發(fā)病率及危害程度相應(yīng)增加。病害侵染早期不顯癥，一旦病菌侵入植株后，可迅速擴展，并且無法挽救，因此小麥全蝕病沒有辦法進(jìn)行治療，只能以早期預(yù)防為主，因此，該病害的早期檢測及預(yù)測預(yù)報就尤為關(guān)鍵和迫切。早期的病害診斷一般以發(fā)病癥狀來判斷，如全蝕病引起的典型“黑腳”、“枯白穗”等癥狀。但這些都是在小麥發(fā)病中后期才能觀察到，危害及損失已經(jīng)無法挽救。因此，建立小麥全蝕病菌的定性、定量檢測技術(shù)，以及土壤中殘留菌源的定量檢測、早期侵染后無癥狀植株的快速檢測，為病害的早期預(yù)防提供技術(shù)支持是一項亟待解決的科學(xué)問題。

本發(fā)明旨在尋找小麥全蝕病菌中新的分子檢測靶標(biāo)基因，并利用該基因設(shè)計出全蝕病菌的特異性的檢測引物，開發(fā)出全蝕病菌實時定量PCR的檢測方法。Ykt6p是一個細(xì)胞存活必須的R-SNARE蛋白，Ykt6在真核生物的進(jìn)化上非常保守，將不同物種中的Ykt6氨基酸序列進(jìn)行比對分析，其具有保守的外顯子編碼序列及變異較大的內(nèi)含子堿基序列。由此我們開發(fā)出以Ykt6作為一個新的分子檢測靶標(biāo)，通過序列比對分析設(shè)計出了小麥全蝕病菌的特異性分子檢測引物，通過實驗驗證，該引物只能在含有小麥全蝕病菌的DNA模版下，特異性的擴增出90bp的條帶，對健康小麥植株、土壤中其它微生物、小麥其它病害擴增不出條帶，因此其具有很好的特異性，避免假陽性的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了全蝕病菌實時定量PCR的檢測技術(shù)，研究并開發(fā)出全蝕病菌在合適條件下侵染最低量閾值，開展土壤中殘留病原菌的定性及定量檢測，為病害的預(yù)警提供依據(jù)，為病害的早期防控提供技術(shù)支持，為小麥的豐產(chǎn)提供保障。

發(fā)明內(nèi)容

1、要解決的問題

針對小麥全蝕病菌發(fā)病較為普遍，危害嚴(yán)重，且難以防控等問題，本發(fā)明提供一種小麥全蝕病菌新的分子檢測靶標(biāo)基因，并利用該基因設(shè)計出全蝕病菌的特異性的檢測引物，開發(fā)出全蝕病菌實時定量PCR的檢測方法，研究并開發(fā)出全蝕病菌在合適條件下侵染最低量閾值，開展土壤中殘留病原菌的定性及定量檢測，為病害的預(yù)警提供依據(jù)。

2、技術(shù)方案

為建立小麥全蝕病預(yù)測預(yù)報機制，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。