[發(fā)明專利]一種蛋白互作阻斷多肽的輔助篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010950586.3
• 申請日: 2020-09-11
• 公開（公告）號: CN112034184B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 紀曉峰;盛軍;鄭媛;郝建華
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: G16B15/30
• 分類號: G16B15/30;G01N33/68
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種篩選中國對蝦蛋白PcRab7和白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP28相互作用的阻斷多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟：

1)構建中國對蝦Rab7蛋白和白斑綜合征病毒W(wǎng)SSV囊膜蛋白VP28的復合體結構PcRab7-VP28；構建方法如下：

①通過蛋白質(zhì)結構預測軟件I-TASSER構建完成PcRab7三級結構；

②通過ZDock2程序生成多個PcRab7-VP28復合體結構，并根據(jù)結合能量進行排序；

③依據(jù)對接結果，選取Auto Dock打分最高的配體構象，確定為PcRab7-VP28的復合體結構；

2)確定復合體結構PcRab7-VP28的相互作用界面；包括如下的步驟：

①通過復合體結構的分子動力學模擬，獲得其分子動力學軌跡；

②利用單一分子動力學軌跡的MM-PBSA能量計算方法，計算PcRab7-VP28之間的結合自由能，分析驅(qū)動PcRab7-VP28可逆結合的主要因素；

③利用MM-GBSA能量分解方法計算PcRab7的各個殘基對結合自由能的貢獻值，確定對PcRab7-VP28結合起決定作用的殘基；

3)以WSSV囊膜蛋白VP28為受體靶標蛋白，根據(jù)其活性區(qū)域設定活性口袋；所述的VP28活性口袋的設置，是選取VP28與PcRab7相互作用界面處接觸的片段為母片段，通過軟件Discovery Studio4.0生成相互作用區(qū)域，包括如下步驟：

①將母片段從兩頭開始截短，選取五肽至八肽之間各個長度片段構成多肽庫1；

②將多肽庫1中所有殘基突變?yōu)槠渌M殘基，包含非極性殘基組：Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Trp，Met；極性殘基組：Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Cys，Gly；帶正電荷組：Lys，Arg，His和帶負電荷組：Asp，Glu，隨機組合構成多肽庫2；

4)將待篩選的多肽片段，在設定的活性口袋位置與受體靶蛋白VP28依次對接，并計算多肽與VP28的結合自由能。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4) 中將待篩選的多肽片段與受體靶蛋白VP28依次對接，是利用REDUCE、Autodock Tools和Autodoc4.2軟件共同完成；其中Autodock對接參數(shù)設定如下：格點間距為盒子為50×50×50的格點組成的正方體區(qū)域，首先為VP28和多肽片段添加氫鍵和Gaussian電荷，再采用多肽和VP28活性位點區(qū)域完全柔性的對接方法，其余參數(shù)設置均為默認值；提取對接結果中的相互作用能，選取聚類中構象結合自由能的平均值作為最終打分結果。

3.一種確定經(jīng)過權利要求1所述的方法篩選后得到阻斷多肽與VP28的結合模式的方法，其特征在于，所述的方法是運用分子動力學軟件Amber16對靶蛋白-多肽片段VP28-IP體系進行分子動力學模擬。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶蛋白-多肽片段VP28-IP體系進行分子動力學模擬，是固定復合體蛋白VP28-IP使水和脂質(zhì)平衡2 ns；然后選取多肽片段全部柔性和活性位點區(qū)殘基為柔性殘基，固定除柔性殘基外的其它殘基的Cα原子，其力常數(shù)從10千卡/摩爾逐漸減至0.1千卡/摩爾；在所有的平衡中，每一步運行10 ns；平衡后，在恒定溫度和壓力下進行了400 ns的MD模擬。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的分子動力學模擬，是以不同的起始原子速度分別進行兩次獨立的動力學模擬；由此產(chǎn)生的軌跡進行使用的amber16軟件包cpptraj模塊分析。