[發(fā)明專利]一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010949803.7
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN111979583B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發(fā)明（設計）人: 張騰龍;楊春燕;梁占超;商宇紅;師雅寧;段小紅;王東亮
• 申請（專利權）人: 杭州求臻醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產(chǎn)權代理有限公司 50219
• 代理人: 姚瓊斯

本發(fā)明涉及生物測序領域，特別涉及一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法及其應用；包括以下步驟：從樣品細胞中獲取單鏈核酸；采用片段化試劑對長鏈的單鏈核酸樣本片段化；在片段化單鏈核酸的3'末端加上基團A；加入5'端被基團B修飾且含有UMI分子標簽的單鏈接頭和鹽離子緩沖液，在室溫條件下，3'修飾基團A的片段化單鏈核酸與5'端修飾基團B單鏈接頭發(fā)生加成反應且連接在一起；加入單向延伸引物1、單向延伸引物2和單鏈延伸試劑，用于由單鏈核酸變成雙鏈核酸；加入測序引物和PCR混合液進行擴增，擴增產(chǎn)物即為測序文庫。本發(fā)明的方法不僅適用于RNA樣品，還適用于ssDNA，操作步驟簡單，具有時間短、成本低、效率高的優(yōu)勢。

技術領域

本發(fā)明涉及生物測序領域，特別涉及一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法及其應用。

背景技術

染色體的易位、倒位或缺失等是造成基因融合的常見發(fā)生機制。隨著下一代測序技術（Next-generation?sequencing，NGS）的發(fā)展，越來越多的研究顯示，融合基因不僅存在于白血病等血液惡性腫瘤中，而且存在于甲狀腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌和腎癌等許多實體腫瘤中，其在腫瘤的發(fā)生過程中扮演著非常重要的角色，約占到腫瘤發(fā)生原因的20%。目前，針對融合基因的靶向藥物和適應癥正在不斷的增加，例如，ALK抑制劑色瑞替尼（Ceritinib)可抑制非小細胞肺癌的進展；NTRK抑制劑拉羅替尼（larotrectinib）可用于治療攜帶NTRK基因融合的晚期復發(fā)實體瘤患者。此外，融合基因還可以作為預后判斷的的分子標志物，如BRC-ABL1的融合轉錄本的表達量可作為化療預后評估的標志物。所以，通過對融合基因的精確檢出，可以為患者的后續(xù)治療提供更多的有效幫助。

臨床上，融合基因診斷的方法主要包括熒光原位雜交（FISH）和RT-PCR等方法。雖然這些方法靈敏度高，但通常只能檢測單個融合基因，操作較復雜，造成診斷時間漫長，性價比較低。同時，這些方法無法識別復雜的結構重排或新的融合基因伴侶，會造成一些假陰性的結果。而基于DNA的測序技術可一次性高通量的檢測多種基因的融合，包括未知融合基因，但這些融合可能出現(xiàn)在內(nèi)含子區(qū)域，沒有轉錄組測序數(shù)據(jù)，便無法判斷融合產(chǎn)生的新基因是否表達或表達量的高低；基于RNA的測序技術，即轉錄組測序技術，可以明確表達的融合基因，能實現(xiàn)更準確的對融合基因的檢測。目前市場上基于RNA測序的融合檢測產(chǎn)品，主要是利用傳統(tǒng)的RNA建庫方法，步驟包括片段化、純化、隨機引物雜交，cDNA合成、第二條鏈合成、末端修復、純化、磷酸化、加A、加接頭、純化、PCR富集和純化，整個流程操作繁瑣，所需試劑種類多、人力和物料成本較高，經(jīng)過多次純化易造成得率下降，且無法區(qū)分母鏈和子鏈。

在高通量文庫構建過程中利用基團化學修飾引入加成反應，此反應的反應條件溫和，不需要任何酶的參與，室溫下即可發(fā)生，可降低對實驗條件的要求，減少器材等成本的投入；而且化學修飾堿基為已知序列，可以有效區(qū)分母鏈和子鏈；同時減少了建庫步驟，縮短了操作時間和操作流程，且能穩(wěn)定性的獲得滿足高通量測序的文庫，適用于更準確的臨床融合基因檢測。

為此，提出一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法及其應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法及其應用，該方法不僅適用于RNA樣品，還適用于ssDNA，操作步驟簡單，具有時間短、成本低、效率高的優(yōu)勢。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，包括以下步驟：

（1）從樣品細胞中獲取單鏈核酸；

（2）采用片段化試劑對長鏈的單鏈核酸樣本片段化；

（3）在步驟（2）后加入含有基團A修飾的NTP試劑和末端轉移酶，用于在片段化單鏈核酸的3'端末端加上基團A；