[發明專利]一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202010949803.7
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN111979583B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 張騰龍;楊春燕;梁占超;商宇紅;師雅寧;段小紅;王東亮
• 申請（專利權）人: 杭州求臻醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 姚瓊斯

1.一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從樣品細胞中獲取單鏈核酸；

(2)采用片段化試劑對長鏈的單鏈核酸樣本片段化；

(3)在步驟（2）后加入含有基團A修飾的NTP試劑和末端轉移酶，用于在片段化單鏈核酸的3'端末端加上基團A；

(4)在步驟（3）后加入5'端被基團B修飾且含有UMI分子標簽的單鏈接頭和鹽離子緩沖液，在室溫條件下，3'端修飾基團A的片段化單鏈核酸與5'端修飾基團B單鏈接頭發生加成反應且連接在一起；

(5)在步驟（4）反應后的溶液中加入單向延伸引物1、單向延伸引物2和單鏈延伸試劑，用于由單鏈核酸變成雙鏈核酸；

(6)在步驟（5）純化后的產物中加入測序引物和PCR混合液進行擴增，擴增產物即為測序文庫。

2.根據權利要求1所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述樣品細胞的來源為人類的新鮮組織、全血、血漿、福爾馬林石蠟包埋樣本、糞便和尿液中的一種，所述單鏈核酸為總RNA、mRNA、ncRNA、lncRNA、cfRNA和ssDNA中的一種。

3.根據權利要求1所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述片段化的時間為1分鐘～20分鐘，所述片段化試劑中的鹽離子為Na⁺，Mg²⁺和Zn²⁺中的一種，所述片段化的溫度為70℃～95℃。

4.根據權利要求3所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述片段化的時間為5～10分鐘，所述片段化的溫度為85℃～95℃。

5.根據權利要求1所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述NTP試劑為ATP、CTP、GTP、UTP和TTP中的一種，所述末端轉移酶為TDT，所述鹽離子緩沖液中的鹽離子為Cu²⁺，所述Cu²⁺的添加量為0.1?nM～1.0nM，所述基團A為疊氮基團，所述基團B為二苯并環辛炔，所述5'端被基團B修飾且含有UMI分子標簽的單鏈接頭序列長度為10～50bp，所述5'端被基團B修飾且含有分子標簽UMI互補序列的單鏈接頭序列由5'端修飾隨機堿基N、分子標簽UMI互補序列以及已知序列A三個部分組成。

6.根據權利要求5所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述NTP試劑為CTP，所述5'端被基團B修飾且含有UMI分子標簽的單鏈接頭序列長度為25～35bp，所述5'端被基團B修飾且含有分子標簽UMI互補序列的單鏈接頭序列為5'-N*-UMI-已知序列A，其中，所述*為DIBO修飾，所述5'端修飾隨機堿基N為A堿基對、T堿基對、C堿基對、G堿基對中的一個，所述分子標簽UMI互補序列4～12個隨機堿基對，所述已知序列A為5～30個已知堿基對。

7.根據權利要求6所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述已知序列A包括5'-AGATCGGAAGAGCGTCGTGT-3'（SEQ?ID?NO.1)的核苷酸序列。

8.根據權利要求1所述的一種單鏈核酸分子高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，所述單向延伸引物1是與含有分子標簽UMI的單鏈接頭的已知序列A部分互補的特異性引物，所述單向延伸引物1的長度為5～60nt，所述單向延伸引物1的序列包括5'-AATGA?TACGGCGACC?ACACC?GAGATCTACAC

NNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ?ID

?NO.2)核苷酸序列，所述單向延伸引物2的序列包括5'-CAAGCAGAAGACG

GCATACGAGATCNNNNNNNNNGTGACTGGAGGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGG-3'?（SEQ?IDNO.3)?核苷酸序列。