[發明專利]通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法

在審

• 申請號: 202010948773.8
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN112185465A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 孫雯;陳瑤;王華
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學附屬口腔醫院
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B40/30;G16B25/10
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 趙艷

本發明公開了一種通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，通過冰凍切片技術獲得不同牙周炎患者及正常對照的牙周組織切片，借助空間轉錄組技術對每個組織樣本進行測序，利用測序所得的空間轉錄組數據進行后續分析，再對所有檢測到的牙周組織不同區域免疫微環境中的細胞種類構成進行分群、鑒定及有效定位，并對不同區域的原始基因的種類和表達情況進行進一步聚類與差異分析，以選出牙周炎免疫調控機制中的關鍵基因及相關分子信號通路。本發明有助于篩選出牙周炎免疫調控機制中的關鍵基因及相關分子信號通路，并最終了解牙周炎的發生發展過程提供強力有效的數據支持。

技術領域

本發明屬于口腔醫學與生物信息技術領域，尤其涉及一種通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法。

背景技術

牙周炎是以牙周組織破壞、牙槽骨吸收、牙齒松動為主要特點的一類慢性炎癥性疾病，是最為常見的口腔炎性疾病之一。流行病學調查顯示，全球牙周炎的患病率高達11.2％，且在40歲左右達患病高峰。

當機體牙周組織受到病原體或病原菌的刺激發生炎癥時，即牙周炎發生時，釋放的炎癥因子將招募免疫細胞聚集于炎癥病灶。然而，在攻擊病原體或病原菌的同時，免疫細胞還會攻擊機體自身正常組織細胞，而口腔作為有菌環境，長期處于帶菌狀態，因而這種炎癥免疫攻擊也將長期持續存在，產生大量炎癥因子，對于機體自身正常組織的損傷較為嚴重，并干擾組織再生修復過程。

研究表明，牙周炎導致的骨組織喪失與炎癥誘導的免疫反應間有著密切聯系。這一過程不僅和單核巨噬細胞、成纖維細胞等介導的固有免疫反應相關，更與T細胞、B細胞所介導的適應性免疫反應關系密切。牙周炎免疫微環境主要是指牙周炎微環境中免疫細胞及免疫相關分子，針對牙周炎微環境中免疫環境的分類有助于了解免疫組成和免疫狀態是如何影響炎癥細胞和牙周炎治療，但現有研究對于牙周炎的具體免疫調控機制尚不明確。因此，針對牙周炎免疫調控機制的研究具有重要現實意義與應用前景，亟需新思路與新方法對牙周炎免疫微環境進行深入探索研究。

針對RNA測序，目前主要的測序方法包括群體轉錄組測序(Bulk RNA-seq)、單細胞測序(single-cell RNA-seq)以及空間轉錄組測序。群體轉錄組測序是檢測每個基因在大的細胞群體中的表達情況，主要用于比較基因組學，可用于比較不同物種的相同組織的基因表達差異；單細胞測序是測定每個基因在單個細胞中的表達情況，更具有微觀性，相比前者能夠檢出混雜樣品測序所無法得到的異質性信息；而空間轉錄組測序，則在單細胞測序的基礎上，額外保留了細胞的空間位置信息，能將基因表達投影到現有空間信息，了解特定細胞與組織切片的相對位置關系。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，旨在解決現有研究方法無法清楚分析和了解牙周炎免疫調控機制的問題。

本發明是這樣實現的，一種通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，該方法包括以下步驟：

(1)通過冰凍切片技術獲得不同牙周炎患者及正常對照的牙周組織切片，

(2)通過空間轉錄組技術對每個組織樣本進行測序，得到空間轉錄組數據；

(3)根據所述空間轉錄組數據進行標準數據分析，對所有檢測到的牙周組織不同區域免疫微環境中的細胞種類構成進行分群、鑒定及有效定位，并對不同區域的原始基因的種類和表達情況進行進一步聚類與差異分析，以選出牙周炎免疫調控機制中的關鍵基因及相關分子信號通路。

優選地，在步驟(2)中，通過空間轉錄組技術對每個組織切片中被載玻片捕獲區域內的寡核苷酸鏈捕獲并標記唯一分子標識符UMI和特殊空間條形碼的mRNA進行測序，得到空間轉錄組數據。

優選地，在步驟(3)中，所述根據所述空間轉錄組數據進行標準數據分析包括以下步驟：

對空間轉錄組數據采用Fastp軟件過濾獲得可直接用于后續分析的測序數據；